 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (841)
- >考研 (96)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (49)
- >導(dǎo)師招生 (34)
- >考博 (23)
- >基金申請(qǐng) (20)
- >論文投稿 (15)
- >碩博家園 (14)
- >教師之家 (12)
- >公派出國(guó) (8)
- >無(wú)機(jī)/物化 (5)
- >文獻(xiàn)求助 (5)
- >休閑灌水 (5)
- >找工作 (4)
- >論文道賀祈福 (3)
- >招聘信息布告欄 (2)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 4532 | 回復(fù): 15 | |||
| 本帖產(chǎn)生 2 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
[求助]
膜蛋白表達(dá)問(wèn)題
|
|||
我最近在做原核生物的膜蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，大致是將目的基因克隆到pET-30a的表達(dá)載體上，然后轉(zhuǎn)化到BL21-DE3的感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE電泳，觀察結(jié)果�？墒乾F(xiàn)在的問(wèn)題是根本就沒(méi)有目的蛋白條帶，所以求有經(jīng)驗(yàn)的蟲(chóng)友們不吝賜教。不勝感激…… |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有145人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 有關(guān)蛋白表達(dá)的問(wèn)題
已經(jīng)有25人回復(fù)
- 關(guān)于在表達(dá)蛋白和GFP蛋白之間的linker
已經(jīng)有11人回復(fù)
- PICZaA在GS115內(nèi)表達(dá)跨膜蛋白
已經(jīng)有30人回復(fù)
- 【求助/交流】如何測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量大小？
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 【求助/交流】求高手指點(diǎn)！關(guān)于用C43（DE3)表達(dá)膜蛋白
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】純化酶切后的膜蛋白做Western blot沒(méi)條帶，why？
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】做過(guò)膜蛋白表達(dá)的看過(guò)來(lái)
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】跨膜蛋白表達(dá)問(wèn)題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】膜蛋白表達(dá)
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白誘導(dǎo)表達(dá)不出目標(biāo)條帶
已經(jīng)有41人回復(fù)
- 【求助/交流】蛋白誘導(dǎo)問(wèn)題咨詢
已經(jīng)有13人回復(fù)
gwbk
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 54
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2293.5
- 紅花: 24
- 帖子: 529
- 在線: 186.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1320681
- 注冊(cè): 2011-06-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-25 20:42:57
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-07-25 20:42:57
|
如果37℃過(guò)夜都不表達(dá)，其他溫度誘導(dǎo)也不會(huì)太理想吧？~ 膜蛋白做起來(lái)難啊。 這是pET手冊(cè)的內(nèi)容： 溫度 37℃生長(zhǎng)常常會(huì)使一些蛋白累積形成包涵體，而30℃生長(zhǎng)則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白(Schein and Noteborn, 1989)。如果你打算利用一些pET 載體中的信號(hào)肽序列輸出蛋白的話，在25℃或30℃生長(zhǎng)和培養(yǎng)可能是最優(yōu)化的。在某些情況下，低溫(15-20℃)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間（過(guò)夜）可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達(dá)到最大。 |
3樓2011-07-25 19:40:39
gwbk
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- MolEPI: 54
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 2293.5
- 紅花: 24
- 帖子: 529
- 在線: 186.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1320681
- 注冊(cè): 2011-06-11
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金幣+4): 2011-07-25 20:13:40
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-07-25 19:53:20
101202139(金幣+4): 2011-07-25 20:13:40
|
正在做這方面實(shí)驗(yàn)，你的情況說(shuō)的不是很清楚。 1，通過(guò)別的手段鑒定是否表達(dá)，如構(gòu)建的克隆基因有某方面功能可以直接用于篩選。我現(xiàn)在做的從克隆構(gòu)一直做到抗性篩選成功，底物濃度從0-0.5，平板抗性梯度很明顯~ 2，菌體PCR或者提質(zhì)粒PCR驗(yàn)證，提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。 3，測(cè)序。 把前期工作做好，然后開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)。 4，蛋白電泳 誘導(dǎo)濃度：IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜誘導(dǎo)，濃度0.5mM，37℃，在加IPTG誘導(dǎo)的同時(shí)加0.1M的底物增大選擇壓力。 5，離心除去菌液上清，加PBS，菌體超聲破碎，一部分離心分為破碎上清和沉淀，一部分跑全蛋白。理論上膜蛋白跑全蛋白就行。 6，優(yōu)化誘導(dǎo)條件。括溫度、時(shí)間等。你可以搜索一下論壇，很多這方面的帖子。 |
2樓2011-07-25 16:52:24
|
首先，克隆肯定是沒(méi)有問(wèn)題的。酶切驗(yàn)證過(guò)，而且也測(cè)過(guò)序列，完全正確。 其次，在誘導(dǎo)表達(dá)蛋白時(shí)，我的膜蛋白A大小是37.5KD，跑SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)有差不多大小的蛋白，另外我又做了膜蛋白B的表達(dá)（目的大小是53.1ＫＤ），跑SDS-PAGE，沒(méi)有目的條帶，而且發(fā)現(xiàn)膜蛋白A的膠圖與膜蛋白B的膠圖很類似。所以很有可能是我的表達(dá)系統(tǒng)的問(wèn)題，下一步就選擇一種普通的蛋白作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)膜蛋白A的目的大小條帶也在普通蛋白膠圖上。總而言之，膜蛋白A、膜蛋白B在表達(dá)宿主菌中均沒(méi)有表達(dá)。不知道是什么情況？ 最后，你說(shuō)的“我現(xiàn)在做的從克隆構(gòu)一直做到抗性篩選成功，底物濃度從0-0.5，平板抗性梯度很明顯~”這句話沒(méi)有太明白。我的目的基因沒(méi)有某方面的功能。 本人是新手，還望多多指點(diǎn)…… |
4樓2011-07-25 20:13:03
5樓2011-07-25 20:17:28
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[碩博家園] 求調(diào)劑 有機(jī)化學(xué)考研356分 +4 | Nadiums 2026-03-25 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 材料與化工328分調(diào)劑 +7 | 。，。，。，。i 2026-03-23 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 277跪求調(diào)劑 +6 | 1915668 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +9 | 張zz111 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +8 | 蕉蕉123 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑求院校招收 +6 | 鶴鯨鴿 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +10 | jjjjjjjjjjl 2026-03-27 | 10/500 |
|
|
|
[有機(jī)交流]
高溫高壓反應(yīng)求助
 10+4
|
chibby 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | 零八# 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 考研調(diào)劑 +4 | Sanmu-124 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +8 | 匹克i 2026-03-23 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +4 | @taotao 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +3 | 丹青奶蓋 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 打過(guò)很多競(jìng)賽，085406控制工程300分，求調(diào)劑 +3 | askeladz 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 332求調(diào)劑 +6 | 032500 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 考研一志愿蘇州大學(xué)初始315（英一）求調(diào)劑 +3 | sbdksD 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 網(wǎng)絡(luò)空間安全0839招調(diào)劑 +4 | w320357296 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +4 | 錦衣衛(wèi)藤椒 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 086003食品工程求調(diào)劑 +6 | 淼淼111 2026-03-24 | 6/300 |
|