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baishaoyun新蟲 (小有名氣)
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[求助]
重組質(zhì)粒構建一直失敗 已有4人參與
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我最近在做原核表達方面的實驗，之前老師已經(jīng)構建好了重組質(zhì)粒，但誘導表達時誘導后和未誘導時表達量并無差別，因為做的是跨膜蛋白胞外段重組表達，就重新設計引物切除了臨近跨膜區(qū)的六個堿基重新構建重組質(zhì)粒，但每次酶切膠回收，連接，轉化，最后菌液PCR鑒定都是陰性，或者弱陽性而提取質(zhì)粒鑒定為陰性結過，擔心PCR產(chǎn)物片段的雙酶切可能效果不好，就連了T載體送公司測序驗證正確后再雙酶切做，然后與相同雙酶切的pet28a-EGFP質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，依然是每次菌液PCR鑒定都無目的條帶出現(xiàn)，而作為對照的連接T載體的重組質(zhì)粒轉化菌菌液PCR鑒定強陽性，前前后后總共做了十多次都沒有成功，求大神幫忙分析下可能的問題所在。 @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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baishaoyun
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長出來的菌落現(xiàn)在懷疑是原來的重組質(zhì)粒目的片段沒切下來又發(fā)生了自連，有做菌液PCR弱陽性而提質(zhì)粒陰性的懷疑目的片段導入了菌體但不能自我復制可能。載體和目的前段比例問題也考慮過，并嘗試過1 :3到1:10之間的多個比例做連接，但始終不得陽性結果。雙酶切電泳膠回收的條帶是可以肯定確實都切下來了并且條帶亮度很好，回收后濃度也都能達到40-150ng/ul之間 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2016-08-04 12:12:48
baishaoyun
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原來構建了三種pET28a-目的基因-EGFP重組質(zhì)粒轉化菌，另外兩種誘導后表達量都明顯增高，就現(xiàn)在打算重新構建的這個當時表達量很低。目的片段是和另外兩種重組質(zhì)粒中的一種經(jīng)相同雙酶切(Sac I和Noc I)膠回收后連接轉化的。內(nèi)切酶和連接酶都用的TAKARA的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2016-08-04 11:58:03
baishaoyun
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懷疑過連接酶或連接酶失效的問題，后來都換了新的重新做過了，感受態(tài)，抗生素也重新買了做也是不行，每次培養(yǎng)也都有菌落出現(xiàn)，但菌液PCR鑒定要么陰性，要么顯示弱陽性而提取質(zhì)粒行PCR鑒定無條帶同時雙酶切切不下來目的條帶。最近做的有一次提質(zhì)粒PCR有弱條帶，但雙酶切鑒定還是沒切下來目的條帶。已經(jīng)做了三個多月了可，實在是很無助呀 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2016-08-04 12:04:37
5樓2016-08-04 13:26:27
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可以換NEB的T4連接酶試試 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
6樓2016-08-04 14:08:07
7樓2016-08-04 14:42:07
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一起做的三個跨膜蛋白基因胞外段的原核表達，除了現(xiàn)在打算重新構建的一個，另外兩個構建好的表達都可以，也都送公司測序過的，應該不會有問題吧 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
8樓2016-08-04 17:41:26
baishaoyun
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目的基因，之前老師已經(jīng)做過整個蛋白的表達的，表達量可以的�，F(xiàn)在讓我做的是這個蛋白胞外段的表達，應該不存在毒性問題吧。引物的話，連接T載體和目的基因的重組質(zhì)粒轉化菌做的陽性對照電泳條帶很明顯的，應該不會有多大問題吧？我也想過菌液PCR有可能不準確，也嘗試過提取質(zhì)粒鑒定，一樣的不行呢。有一次的做質(zhì)粒PCR有弱條帶，里邊會不會有可能混有少量重組質(zhì)粒呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
9樓2016-08-04 17:52:23
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因為你是同時做的三個載體 所以如果只有一個有問題的話 可能這個目的片段出問題的幾率大一點 我看樓上說表達的蛋白有毒性 這個可能性也很大 不如你查查文獻 看看有沒有類似的情況？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
10樓2016-08-04 18:07:56
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