 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 4 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2146 | 回復(fù): 3 | ||
liliuyan新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
如何做一個(gè)基因的熒光定量pcr,從目的基因的查找，引物設(shè)計(jì)，... 已有1人參與
|
|
如何做一個(gè)基因的熒光定量pcr,從目的基因的查找，引物設(shè)計(jì)，到做一個(gè)完整的熒光定量pcr具體的步驟。萬(wàn)分感謝 。跪求。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶端 |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有75人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有15人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 真菌的絕對(duì)定量熒光pcr如何做標(biāo)準(zhǔn)曲線
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 熒光定量PCR引物的選擇
已經(jīng)有1人回復(fù)
- 熒光定量不同板之間的比較，沒(méi)有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因如何做？
已經(jīng)有0人回復(fù)
- 水稻材料做熒光定量，取樣品及后續(xù)實(shí)驗(yàn)該怎么操作
已經(jīng)有0人回復(fù)
- 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理——SD值及方差分析
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 如何在絲狀真菌中表達(dá)如何蛋白
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 熒光定量PCR的相對(duì)定量怎么用？
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 熒光定量pcr,以及內(nèi)參基因的選擇。
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 原位雜交 與 gus 染色 需不需要都做
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 拿到基因全長(zhǎng)，做什么？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 如何讓綠色熒光蛋白在Hela細(xì)胞中表達(dá)
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 熒光定量的蟲(chóng)友們交流交流
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】這種情況下如何做熒光定量啊
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】ACTIN基因如何尋找~~Actin-like基因是什么？？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】人類(lèi)基因的污染
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 熒光定量PCR反應(yīng)中的對(duì)照如何設(shè)定
已經(jīng)有0人回復(fù)
- 【分享】realtime pcr 個(gè)人經(jīng)驗(yàn)分享
已經(jīng)有41人回復(fù)
- 【專(zhuān)題】PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南
已經(jīng)有535人回復(fù)
莫等閑111
版主 (知名作家)
- 應(yīng)助: 67 (初中生)
- 貴賓: 4.496
- 金幣: 86640.9
- 散金: 10147
- 紅花: 230
- 沙發(fā): 6
- 帖子: 7123
- 在線: 1196.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 4086716
- 注冊(cè): 2015-09-20
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 微生物學(xué)
- 管轄: 外文書(shū)籍求助
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
|
1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶） 1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。 2）取100mg組織，加入到勻漿器中。 3）充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊。 4）13000g離心10min取上清。 5）加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。 6）4℃下13000g離心8min。 7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。 8）-20℃放置15min。 9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。 10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。 11）4℃下13000g離心5min。 12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3min。 13）加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。 14）55℃孵育5min。 2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶） 1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。 2）加入1μl oligo(dT)15。 3）用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。 4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。 5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。 6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。 3、定量PCR 1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。 2× qPCR Mix 12.5μl 7.5μM基因引物 2.0μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl ddH2O 8.0μl 2）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5μl 7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl ddH2O 8.0μl 3）PCR擴(kuò)增 預(yù)變性 95℃，10min 循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s 溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃ 4、結(jié)果處理 ΔΔCT法： A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本) B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本) K=A-B 表達(dá)倍數(shù)=2-K 注意事項(xiàng) 1、長(zhǎng)度：15—30bp。 2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間。 3、堿基分布的隨機(jī)性 4、引物自身：最好不要含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。 5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。 6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。 7、3’末端：如果可能的話，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。 8、設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，上下游引物要跨內(nèi)含子，以消除基因組DNA的干擾。 9、引物設(shè)計(jì)好后再NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，檢查是否可能有錯(cuò)配產(chǎn)物擴(kuò)增。 10、引物設(shè)計(jì)要注意種屬。 |
2樓2017-02-13 22:27:58
莫等閑111
版主 (知名作家)
- 應(yīng)助: 67 (初中生)
- 貴賓: 4.496
- 金幣: 86640.9
- 散金: 10147
- 紅花: 230
- 沙發(fā): 6
- 帖子: 7123
- 在線: 1196.2小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 4086716
- 注冊(cè): 2015-09-20
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 微生物學(xué)
- 管轄: 外文書(shū)籍求助
3樓2017-02-13 22:30:46
4樓2017-02-13 23:13:57
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 liliuyan 的主題更新
| 4 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +8 | 新時(shí)代材料 2026-03-27 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +7 | 孅華 2026-03-22 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 286求調(diào)劑 +3 | 丟掉懶惰 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑，各位老師看看我！�。� +5 | 祁祺祺 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0703一志愿9，初試成績(jī)：338，四六級(jí)已過(guò)，有科研經(jīng)歷，求調(diào)劑！ +3 | Zuhui0306 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085601 材料工程 313分 求調(diào)劑 +5 | Ong3 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 316求調(diào)劑 +5 | Pigcasso 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 314求調(diào)劑 +3 | 溪云珂 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 304材料求調(diào)劑
+4
|
鐘llll 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 342求調(diào)劑 +3 | 加油a李zs 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +5 | 材料cailiao 2026-03-21 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 【雙一流院校新能源、環(huán)境材料，材料加工與模擬招收大量調(diào)劑】 +4 | Higraduate 2026-03-22 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 085602化學(xué)工程求調(diào)劑。
+4
|
平樂(lè)樂(lè)樂(lè) 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境專(zhuān)碩324分求調(diào)劑推薦 +5 | 軒小寧—— 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 26考研-291分-廈門(mén)大學(xué)（085601）-柔性電子學(xué)院材料工程專(zhuān)業(yè)求調(diào)劑 +3 | min3 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 各位老師您好：本人初試372分 +5 | jj涌77 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +5 | plum李子 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑 +3 | 冬十三 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 277分求調(diào)劑，跨調(diào)材料 +3 | 考研調(diào)劑lxh 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)調(diào)劑 +4 | 妮妮ninicgb 2026-03-21 | 4/200 |
|