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liliuyan新蟲(chóng) (初入文壇)
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如何做一個(gè)基因的熒光定量pcr,從目的基因的查找，引物設(shè)計(jì)，... 已有1人參與
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如何做一個(gè)基因的熒光定量pcr,從目的基因的查找，引物設(shè)計(jì)，到做一個(gè)完整的熒光定量pcr具體的步驟。萬(wàn)分感謝 。跪求。 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
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莫等閑111
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西門(mén)吹雪170: 金幣+5, 鼓勵(lì)熱心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
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1、總RNA抽提（槍頭和離心管均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶） 1）取勻漿器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷。 2）取100mg組織，加入到勻漿器中。 3）充分研磨直至無(wú)可見(jiàn)組織塊。 4）13000g離心10min取上清。 5）加入250 μl三氯甲烷，顛倒離心管15s，充分混勻，靜置3min。 6）4℃下13000g離心8min。 7）將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻。 8）-20℃放置15min。 9）4℃下13000g離心10min，管底的白色沉淀即為RNA。 10）吸除液體，加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。 11）4℃下13000g離心5min。 12）將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3min。 13）加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。 14）55℃孵育5min。 2、反轉(zhuǎn)錄（槍頭和PCR均經(jīng)過(guò)濕熱滅菌，無(wú)RNA酶） 1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。 2）加入1μl oligo(dT)15。 3）用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。 4）于PCR儀上70℃保溫5min，迅速置冰上冷卻。 5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。 6）于PCR儀上42℃保溫60min，結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。 3、定量PCR 1）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。 2× qPCR Mix 12.5μl 7.5μM基因引物 2.0μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl ddH2O 8.0μl 2）取0.2ml PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5μl 7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl ddH2O 8.0μl 3）PCR擴(kuò)增 預(yù)變性 95℃，10min 循環(huán)（40次） 95℃，15s→60℃，60s 溶解曲線(xiàn) 75℃→95℃，每20s升溫1℃ 4、結(jié)果處理 ΔΔCT法： A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本) B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本) K=A-B 表達(dá)倍數(shù)=2-K 注意事項(xiàng) 1、長(zhǎng)度：15—30bp。 2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間。 3、堿基分布的隨機(jī)性 4、引物自身：最好不要含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。 5、引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。 6、上下游引物的互補(bǔ)性：一個(gè)引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。 7、3’末端：如果可能的話(huà)，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。 8、設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，上下游引物要跨內(nèi)含子，以消除基因組DNA的干擾。 9、引物設(shè)計(jì)好后再NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，檢查是否可能有錯(cuò)配產(chǎn)物擴(kuò)增。 10、引物設(shè)計(jì)要注意種屬。 |
2樓2017-02-13 22:27:58
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