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咱小涼新蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
熒光原位雜交FISH鏡檢計(jì)數(shù) 已有3人參與
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小妹用熒光原位雜交法，測(cè)樣品中被熒光標(biāo)記細(xì)菌總數(shù)。 1、雜交完后，制作好的載玻片，在普通熒光顯微鏡下觀察就可以還是要激光共聚焦顯微鏡，有什么區(qū)別？如果要看一般放大多少倍合適。 2、鏡檢的時(shí)候怎么計(jì)數(shù)呢？文獻(xiàn)只查到數(shù)十幾個(gè)隨機(jī)視野，求平均值。怎么把這個(gè)結(jié)果換算成cell/ml菌液。 3、是否可以用流式細(xì)胞計(jì)算細(xì)菌總數(shù)，比載玻片鏡檢有什么優(yōu)缺？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
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我不是做細(xì)菌的，但是你這個(gè)用普通的熒光顯微鏡就好！計(jì)數(shù)一般一個(gè)視野，計(jì)上不記下，記左不記右吧！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2017-03-19 10:30:53
咱小涼
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有木有具體的方法呢？不過(guò)別說(shuō)計(jì)數(shù)了，今天把做好的片子拿去看了，那邊儀器的老師說(shuō)找不到菌，看到的不知道是菌還是雜質(zhì)，探針cy3標(biāo)記的，然后dapi復(fù)染，暗視野紫外光只看到很少的幾個(gè)藍(lán)點(diǎn)，綠光下一片橙紅色然后好多一粒一粒的顆粒連成片，不知道是不是菌。我甚至不知道應(yīng)該是什么樣的。第一次做感覺(jué)好絕望。也不知道方法對(duì)不對(duì)。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
3樓2017-03-20 16:48:37
Cells-Qi
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西門(mén)吹雪170: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流 2017-03-21 07:45:48
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連成片可能是濃度太大，稍微稀釋一下再做片子！菌的話(huà)一般四十倍鏡下就能看到啦！ 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
4樓2017-03-21 00:22:14
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載玻片和蓋玻片用前先用酒精浸泡八個(gè)小時(shí)以上，然后在用，用以?xún)艋Ｆ?br />
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5樓2017-03-21 00:26:48
咱小涼
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老師我按照這個(gè)方法做的，您看對(duì)嗎？ 1、菌液+4%多聚甲醛固定，過(guò)夜 2、離心棄上清液，加0.01Mpbs混懸再離心棄掉上清液，重復(fù)一次，重懸0.01Mpbs:乙醇=1:1的溶液，-20度待用。 3、上液取20ul于載玻片，晾干，50%、80%、96%乙醇依次泡3min，晾干。 4、加熒光標(biāo)記引物5ul和雜交緩沖液（自己配的，含甲酰胺、tris-hcl，nacl，sds），46度恒溫箱雜交過(guò)夜。 5、雜交完后用清洗液清洗（tris-hcl，nacl，sds，edta，dapi） 6、在冰水里清洗幾秒 封片鏡檢。 是不是清洗不夠。老師您如果有時(shí)間方便線下加個(gè)好友指導(dǎo)下嗎？ 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
6樓2017-03-21 01:15:16
咱小涼
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載玻片由于直接買(mǎi)的多聚賴(lài)氨酸包被的，就沒(méi)浸泡直接用了。還有加菌液晾干后，三種濃度乙醇脫水時(shí)總覺(jué)得菌液會(huì)被沖洗掉，用的染色缸，側(cè)面豎著泡進(jìn)去的。雜交緩沖液50ul和探針5ul好像量太多，加蓋玻片后就溢出來(lái)了，不知道有木有影響。 發(fā)自小木蟲(chóng)IOS客戶(hù)端 |
7樓2017-03-21 01:20:00
走過(guò)最后的
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8樓2017-09-11 14:09:03
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9樓2017-09-17 23:50:57
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10樓2017-09-17 23:52:42
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