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熒光原位雜交FISH鏡檢計數(shù) 已有3人參與
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小妹用熒光原位雜交法，測樣品中被熒光標記細菌總數(shù)。 1、雜交完后，制作好的載玻片，在普通熒光顯微鏡下觀察就可以還是要激光共聚焦顯微鏡，有什么區(qū)別？如果要看一般放大多少倍合適。 2、鏡檢的時候怎么計數(shù)呢？文獻只查到數(shù)十幾個隨機視野，求平均值。怎么把這個結(jié)果換算成cell/ml菌液。 3、是否可以用流式細胞計算細菌總數(shù)，比載玻片鏡檢有什么優(yōu)缺？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2017-03-19 10:30:53
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有木有具體的方法呢？不過別說計數(shù)了，今天把做好的片子拿去看了，那邊儀器的老師說找不到菌，看到的不知道是菌還是雜質(zhì)，探針cy3標記的，然后dapi復(fù)染，暗視野紫外光只看到很少的幾個藍點，綠光下一片橙紅色然后好多一粒一粒的顆粒連成片，不知道是不是菌。我甚至不知道應(yīng)該是什么樣的。第一次做感覺好絕望。也不知道方法對不對。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
3樓2017-03-20 16:48:37
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連成片可能是濃度太大，稍微稀釋一下再做片子！菌的話一般四十倍鏡下就能看到啦！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2017-03-21 00:22:14
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5樓2017-03-21 00:26:48
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老師我按照這個方法做的，您看對嗎？ 1、菌液+4%多聚甲醛固定，過夜 2、離心棄上清液，加0.01Mpbs混懸再離心棄掉上清液，重復(fù)一次，重懸0.01Mpbs:乙醇=1:1的溶液，-20度待用。 3、上液取20ul于載玻片，晾干，50%、80%、96%乙醇依次泡3min，晾干。 4、加熒光標記引物5ul和雜交緩沖液（自己配的，含甲酰胺、tris-hcl，nacl，sds），46度恒溫箱雜交過夜。 5、雜交完后用清洗液清洗（tris-hcl，nacl，sds，edta，dapi） 6、在冰水里清洗幾秒 封片鏡檢。 是不是清洗不夠。老師您如果有時間方便線下加個好友指導(dǎo)下嗎？ 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
6樓2017-03-21 01:15:16
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載玻片由于直接買的多聚賴氨酸包被的，就沒浸泡直接用了。還有加菌液晾干后，三種濃度乙醇脫水時總覺得菌液會被沖洗掉，用的染色缸，側(cè)面豎著泡進去的。雜交緩沖液50ul和探針5ul好像量太多，加蓋玻片后就溢出來了，不知道有木有影響。 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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