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bulebird金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】求助釀酒酵母轉(zhuǎn)化 已有3人參與
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我在實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題是：轉(zhuǎn)化A+KanMX+B這個(gè)片段進(jìn)入釀酒酵母基因組（A,B片段分別是釀酒酵母X基因外部上下游約500bp的同源區(qū)），得到X基因缺失的轉(zhuǎn)化子。重組后一方面將KanMX基因引入酵母染色體，使重組菌株產(chǎn)生G418抗性；另一方面，KanMX片段同源重組替換了酵母染色體上的X基因，從而實(shí)現(xiàn)該基因的敲除。 用抗性基因的上下游引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子能正確擴(kuò)增KanMX抗性基因大小的片段，但是在X基因外部和KanMX抗性基因內(nèi)部設(shè)計(jì)的一對(duì)引物擴(kuò)增，始終沒有擴(kuò)增出來（應(yīng)該不是PCR的問題）。我懷疑是轉(zhuǎn)化過程遇到了問題，導(dǎo)致的假陽性。 想請(qǐng)教釀酒酵母電轉(zhuǎn)化的方法，及一些注意事項(xiàng)。 如果哪位蟲友知道某個(gè)研究所或企業(yè)能做這方面的實(shí)驗(yàn)，向我介紹一下。合作也可以。 謝謝�。�！ |
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iaminxanadu
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scelab(金幣+3):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-16 22:00
bulebird(金幣+2): 2010-05-04 10:53
scelab(金幣+3):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-04-16 22:00
bulebird(金幣+2): 2010-05-04 10:53
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500bp的同源序列不需要做電轉(zhuǎn)的，你怎樣驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子啊？是挑的純的單菌落嗎？我懷疑，你的體系污染造成的假陽性（PCR或者菌落與轉(zhuǎn)化物） 建議重新轉(zhuǎn)化，抗性板做的仔細(xì)，菌落挑好重接新的抗性板后再做菌落PCR。 另外，電轉(zhuǎn)的方法也很簡單，你不做文庫篩選，按照一般英文的Protocol都行。 |
2樓2010-04-16 14:57:41
susizheng
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3樓2010-04-26 11:26:30
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4樓2010-07-11 19:40:49
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