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[交流]
【求助/交流】大量金幣感謝，基因克隆表達(dá)。 已有12人參與
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我想在E.coli中表達(dá)一個外源基因，并且要這個基因表達(dá)出來具有酶活性，能夠轉(zhuǎn)化底物，合成新的產(chǎn)物。但是有一點(diǎn)不明白的就是：在克隆外源基因的時候，從ATG開始，到TAA結(jié)束？還是從更上游的位置開始到更下游的位置結(jié)束？這兩者之間有什么區(qū)別呢？ 第二個問題：如果在同一載體上克隆表達(dá)兩個基因，這兩個基因如何連接呢？是第一個基因的TAA直接續(xù)接第二個基因的ATG？還是中間需要添加一些片段？ 各位大俠啊：我是在讀的碩士研究生，要開展分子生物學(xué)的課題。由于導(dǎo)師在這方面不太精通，因此求助一個問題。 [ Last edited by zhmy26 on 2010-5-12 at 08:28 ] |
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2樓2010-05-05 08:44:45
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zhmy26(金幣+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金幣+4):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
zhmy26(金幣+2): 2010-05-05 13:54:51
scelab(金幣+4):熱心蟲友，歡迎多來交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-05 15:33:31
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有很多載體可以選擇，比如pet系列的�？茨愕囊螅憧梢允褂梅侨诤媳磉_(dá)，即表達(dá)時不帶標(biāo)簽，可以表達(dá)出天然的目的蛋白。一般表達(dá)載體都是載體具有啟動子的，不需要自行添加，你只需將目的基因插入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)就可以了，至于終止，你可以使用載體上的終止子，你也可以在設(shè)計(jì)引物時自己加上雙終止子TGATAA，我們一般都是自己加雙終止子。表達(dá)的時候，載體是從啟動子之后的第一個ATG開始表達(dá)，直到終止密碼子。 第二個問題，現(xiàn)在有很多雙表達(dá)系統(tǒng)可以選擇，這種系統(tǒng)具有多個啟動子，可以插入多個目的基因，這種系統(tǒng)表達(dá)出來的每個蛋白是獨(dú)立分開的。而樓上介紹的SOE拼接表達(dá)出來的兩個蛋白一般是連在一起的。 |
3樓2010-05-05 09:34:30
fungixx
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4樓2010-05-05 09:40:27
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5樓2010-05-05 13:43:59
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zhmy26(金幣+1): 2010-05-11 15:19:09
感覺樓上幾位說的已經(jīng)很好了，自己也羅嗦幾句，我也剛開始基因的學(xué)習(xí)，第一個問題可以按照1樓的做法，不過似乎你是想一次性連接2個基因到一個載體上，我們實(shí)驗(yàn)室的一個師兄做的也是多基因連接，好像是直接連到一起的，至于雙表達(dá)系統(tǒng)，可以學(xué)習(xí)一下，我感覺樓主現(xiàn)在似乎還不是很清楚自己的蛋白是連載一起的還是獨(dú)立的，要是這樣的話，可以用兩個方法都試試，也可以自己再去查文獻(xiàn)證實(shí)后再決定，反正就是一個從理論入手一個從實(shí)踐做起，都可以解決。祝樓主好運(yùn)~~ |
10樓2010-05-11 09:21:02
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