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zj0726銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】RT-PCR 已有4人參與
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| 大家做RT-PCR時(shí)，RNA加多少？CDNA加多少呀？最近做RT-PCR，結(jié)果老是不很理想，P出來(lái)的條帶不亮，不知道是哪出了問題，請(qǐng)高手們指點(diǎn)一下 |
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zhwenxing
木蟲 (著名寫手)
尛森蟲
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1949stone(金幣+2):很熱心 很細(xì)致 2010-05-19 18:44:18
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1949stone(金幣+2):很熱心 很細(xì)致 2010-05-19 18:44:18
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煩請(qǐng)樓主將問題說得清楚一些，具體的實(shí)驗(yàn)步驟如何做的，大家才能各抒己見哈。O(∩_∩)O哈哈~ 1、您是一步法還是兩步法？一步法的話，考慮RNA的純度問題，還有反應(yīng)體系的精確性。兩步法的話，先反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)不同的逆轉(zhuǎn)錄酶的要求去考量RNA的用量。 2、如果您用的是總RNA的話，比如promega的m-mlv，那么，25ul的反應(yīng)體系，需要加入量為2-3ug，酶的用量為200U，如果用AMV的話，需要25U就足夠了，但是其內(nèi)切酶活性等均會(huì)升高。自己根據(jù)酶的性質(zhì)來(lái)確定。 3、如果用mRNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板會(huì)好很多，不知您是否需要純化mRNA。 4、擴(kuò)增如Actin之類的基因檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄的結(jié)果并不能準(zhǔn)確的定量反轉(zhuǎn)錄的效率。 …… |
2樓2010-05-19 17:46:40
zj0726
銅蟲 (小有名氣)
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3樓2010-05-19 17:53:30
skywalkerelf
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4樓2010-05-21 09:06:47
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5樓2010-05-21 09:42:21
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6樓2010-05-21 14:43:13
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