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[交流] 【求助/交流】PCR問題已有8人參與

用引物做PCR擴(kuò)增一核心片段，以前擴(kuò)出來過，并且很特異，帶很亮，回收了，轉(zhuǎn)化沒成功，重新擴(kuò)，再也擴(kuò)不出來了，怎么辦？現(xiàn)在所有的試劑、反應(yīng)條件都跟以前一摸一樣，PCR后跑電泳卻只有很長的拖帶，請問是怎么回事？如何才能重新把那條帶擴(kuò)出來？期待高人指點(diǎn)!!!

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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了

1樓 2010-06-17 09:36:24

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陳思容

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1949stone(金幣+1):謝謝交流 2010-06-17 12:01:11

提高退火溫度

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2樓2010-06-17 09:40:05

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jasco

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用你上次擴(kuò)出來的產(chǎn)物做模板再做pcr試試

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3樓2010-06-17 11:02:40

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j2

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1949stone:我也遇到過 2010-06-17 12:01:22

前段時間我也是不知道為什么就P不出來了，所有條件一樣，后來重提了模板，降低了退火溫度，又出來了，至今不知道是什么原因~

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修煉ｉｎｇ，當(dāng)蟲仙……

4樓2010-06-17 11:18:04

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Originally posted by j2 at 2010-06-17 11:18:04:
前段時間我也是不知道為什么就P不出來了，所有條件一樣，后來重提了模板，降低了退火溫度，又出來了，至今不知道是什么原因~

是不是與環(huán)境溫度有關(guān)啊，我冬天和春天都擴(kuò)的出來，一到夏天就擴(kuò)不出來了，是不受溫差影響很大？我降了退火溫度擴(kuò)不出來，升了也擴(kuò)不出來。以前的退火溫度是60度，是不設(shè)計(jì)引物時就不該選這么高退火溫度的？好像說如果引物單上寫的是60度，實(shí)際就得用65度，是這樣嗎？

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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了

5樓2010-06-17 15:32:05

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琴瑟不鳴

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模板的問題。，。降解了。。�；蚴窍♂尡壤蓡栴}

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老虎

6樓2010-06-17 15:36:30

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reallysnow

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7樓2010-06-17 15:39:03

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可可貓

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還有buffer什么的也要注意

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8樓2010-06-17 16:03:30

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lmzxcom1

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dhd997(金幣+2):熱心斑斑。 2010-06-17 16:06:19

你的模板降解了，用以前的PCR產(chǎn)物作為模板擴(kuò)增，注意DNA要零下20度保存，不要反復(fù)凍容

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9樓2010-06-17 16:05:23

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Originally posted by lmzxcom1 at 2010-06-17 16:05:23:
你的模板降解了，用以前的PCR產(chǎn)物作為模板擴(kuò)增，注意DNA要零下20度保存，不要反復(fù)凍容

新模板，擴(kuò)b-actin擴(kuò)的很好，就是擴(kuò)目的基因擴(kuò)不出來�？赡苁菢悠酚袉栴}，在這個季節(jié)是繁殖季節(jié)，可能這個基因關(guān)閉了

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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了

10樓2010-06-17 17:02:54

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