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wdongdong金蟲(chóng) (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】蛋白純化 已有3人參與
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我最近在做GST-PULL DOWN ，但純化的HIS融合蛋白量太低，用的是NOVAGEN 的柱子，雜帶到是沒(méi)什么了，只是純化的量都不到1mg/ml,所以沒(méi)法往下做了，請(qǐng)問(wèn)哪位高手做過(guò)，給點(diǎn)建議,HIS融合蛋白的純化步驟如下： 用的 buffer: 8 Binding Buffer （8×= 4M NaCl，160mM Tris-HCl，40mM imidazole，pH 7.9） 8×Wash Buffer （8×= 4M NaCl，480mM imidazole，160mM Tris-HCl，pH 7.9） 4×Elute Buffer （4×= 4M imidazole，2M NaCl，80mM Tris-HCl，pH 7.9） 4×Strip Buffer （4×= 2M NaCl，400mM EDTA，80mM Tris-HCl，pH 7.9） 8×Charge Buffer （8×= 400mM NiSO4） 買(mǎi)的是預(yù)裝柱子，所以直接純化： 1、取下預(yù)裝柱蓋子，盡量吸出上方所有保存緩沖液，去掉柱下 Luer 鎖緊套口。 2、10ml 1×結(jié)合緩沖液平衡樹(shù)脂后讓所有緩沖液盡量流盡。 注意：若未能完全去掉保存液和徹底平衡樹(shù)脂，樹(shù)脂的結(jié)合力會(huì)降低，也可能導(dǎo)致目的蛋白在純化過(guò)程中及后續(xù) 的透析步驟中析出形成沉淀。 柱層析純化目的蛋白 1、待結(jié)合緩沖液流干，進(jìn)行上樣（即適量已準(zhǔn)備好的細(xì)菌裂解物）。 2、10ml 1×結(jié)合緩沖液洗柱。 3、10ml 1×漂洗緩沖液洗柱。 4、5ml 1×洗脫緩沖液洗脫結(jié)合蛋白。另外，也可使用5ml 1×剝離緩沖液將結(jié)合蛋白和 Ni2+同時(shí)從柱上洗脫下 來(lái)。若需要可分段收集洗脫組分（如每1ml 收集一管）。 哪位高手指教一下，謝謝 |
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2樓2010-06-23 20:47:36
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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-06-24 15:17:44
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dhd997(金幣+1):謝謝交流。 2010-06-24 15:17:44
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washing使用60mM的咪唑有點(diǎn)高了。這個(gè)不是固定值，蛋白結(jié)合力比較弱的話都被你給洗掉完了。 washing buffer的濃度最好進(jìn)行探試，在蛋白獲得量和蛋白的純度中間取個(gè)均衡。有些時(shí)候可以選擇大量低濃度的咪唑洗脫。 如果你不愿意降低washing buffer的濃度，那就大量搖菌吧，一次搖個(gè)4-8L的，換個(gè)大柱子，純化完了使用超濾管濃縮。 [ Last edited by 月月大可 on 2010-6-24 at 14:43 ] |
3樓2010-06-24 14:41:33
dianaofyezi
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4樓2010-06-27 11:33:10
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