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gsf313鐵蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】分步酶切 回收 求助 已有13人參與
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我切一個(gè)載體，Ecor I 和 Xho I，寶生物的酶，這兩個(gè)酶的buffer都是1xk 因?yàn)閮蓚�(gè)酶切位點(diǎn)之間只差6個(gè)堿基，所以同時(shí)雙酶切老是切不開。分步酶切的話，第一次用Ecor I切完，用膠回收試劑盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，總是收不回來(lái)片段。 我現(xiàn)在想用30/50ul 體系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 質(zhì)粒，補(bǔ)水到30ul，切三個(gè)小時(shí)，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水補(bǔ)到50ul，再切三小時(shí)，大家看可行么？給點(diǎn)建議啊，我快急瘋了，眼看就畢不了業(yè)了…… 補(bǔ)充一些疑問(wèn)點(diǎn)：1。第一次酶切后，需不需要加熱使酶失活，然后再進(jìn)行下一步？如果需要，怎么加熱？多少度？加熱多久？ 2。加第二個(gè)酶的時(shí)候，10XK buffer 加5ul 還是3ul？ 因?yàn)閮蓚�(gè)酶的buffer一樣，所以有此疑問(wèn) |
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ben1147
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4樓2010-06-26 09:16:47
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