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101wenjing金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【其他】pcr產(chǎn)物直接測(cè)序后結(jié)果比對(duì)問題 已有3人參與
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做菌種鑒定時(shí)，用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序， 細(xì)菌使用通用引物PCR，雙向測(cè)序得到1100bp左右的PCR產(chǎn)物的正反向兩條序列，現(xiàn)在有幾個(gè)問題哈 1、正反向兩條序列如何拼接？是不是需要正反向拼接了才能blast比對(duì)呀？還是單鏈就可以？哪種處理準(zhǔn)確性好呢？ 2、序列比對(duì)：網(wǎng)上說法是得到的測(cè)序結(jié)果全部都放到blast里去，老師告訴我說序列比對(duì)時(shí)要找保守序列，比如在所得序列中查找GGCGG或者GCAGC這樣的結(jié)構(gòu)，然后掐頭去尾再去比對(duì)，不知道序列比對(duì)時(shí)候的具體操作是什么��？ 3、我看很多說法是 克隆測(cè)序 ，這與直接測(cè)序有哪些區(qū)別�。� 4、以上問題有什么參考資料可以借鑒啊？ 謝謝各位蟲有解答我心中的疑惑 |
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xp198766
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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lstt09nk(金幣+3):歡迎分享經(jīng)驗(yàn)~~ 2010-08-17 11:54:35
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1、首先，你要把正反序列拼接成一條序列，再去比對(duì)，要不，你測(cè)序的信息就沒有利用完全，雙向測(cè)序得到的兩條序列，你先看峰圖，把那些很亂的部分要去掉，峰圖很亂說明測(cè)序不準(zhǔn)，去掉很亂的部分之后，一般一條序列長(zhǎng)度應(yīng)該為700-800bp左右（一個(gè)反應(yīng)的測(cè)序精度一般為700bp） 2、我想你是問如何拼接是吧？你們老師應(yīng)該是告訴你如何拼接序列，原理就是，先讓兩條序列正反向一致（如果你是雙向測(cè)序的話，一般是把一條序列變成反向互補(bǔ)序列就行了），兩條序列肯定會(huì)有重復(fù)，一般是a的前端與b的后端重復(fù)（或a的后端與b的前端重復(fù)），選擇a的前端的部分序列與b的后端比對(duì)，找到重復(fù)，再將別的序列連接在重復(fù)的兩端（第二種情況也一樣），不知道你清楚不，就是雙向測(cè)序的話，中間肯定有重復(fù)的，找到重復(fù)就行了…… 拼接好序列后，直接到NCBI里面的BLAST里面，選擇BLASTn，物種選others，默認(rèn)設(shè)置就可以了…… 3、克隆測(cè)序的話，可以將pcr得到的結(jié)果序列全測(cè)出來，直接純化測(cè)序的話，兩端的序列，可能有50bp左右會(huì)測(cè)不準(zhǔn)（峰圖較亂），還有克隆測(cè)序的話，由于是轉(zhuǎn)到質(zhì)粒里面，序列是純的，pcr有可能有雜帶污染 4、上面是我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，參考資料不清楚 [ Last edited by xp198766 on 2010-8-17 at 09:20 ] |
2樓2010-08-17 09:19:16
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