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癡書小孩鐵桿木蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助】PCR退火溫度及時間如何確定 已有9人參與
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我是新人，還不懂，是不是跟引物Tm有關(guān)，如何算呢，還有就是PCR每步的時間怎么算的，望大家指點 [ Last edited by amisking on 2010-8-25 at 20:42 ] |
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4樓2010-08-25 14:35:21
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熔解溫度（Tm）是引物的一個重要參數(shù)。這是當(dāng)50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。 設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。 有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。 為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 |
5樓2010-08-25 16:00:02
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10樓2010-08-27 08:10:47
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