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543608268金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】BL21表達(dá) 已有1人參與
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求助 BL21表達(dá)時有包涵體 怎么辦？ IPTG濃度最低要求為多少 ？ |
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evan1987
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jia1012428
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lstt09nk(金幣+3):不錯~ 2010-09-08 09:12:28
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在大腸桿菌中，當(dāng)外源蛋白高水平表達(dá)的時候，極易形成包涵體，為蛋白純化等下游工作帶來很大的麻煩。 下面是一些可以參考的有助于提高目的蛋白可溶性表達(dá)的實驗方案： 1.降低蛋白合成的速度�？梢酝ㄟ^以下方法實現(xiàn)： a.降低培養(yǎng)溫度 b.使用弱啟動子 c.使用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒表達(dá)載體 d.降低誘導(dǎo)物的濃度 2.改變培養(yǎng)基。 a.培養(yǎng)基中加入可以幫助蛋白折疊的因子 b.加入緩沖液保持pH穩(wěn)定 c.加入1%的葡萄糖，抑制lac啟動子 d.加入山梨糖醇等可以穩(wěn)定蛋白天然結(jié)構(gòu)的因子 e.加入乙醇， thiols and disulfides等 3.與分子伴侶或折疊酶共表達(dá)。 常用的分子伴侶有： GroES-GroEL DnaK-DnaJ-GrpE ClpB 常用的折疊酶有： peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPI's) disulfide oxidoreductase (DsbA) and disulfide isomerase (DsbC) protein disulfide isomerase (PDI) 4.分泌表達(dá)。使目的蛋白分泌到周質(zhì)空間。 周質(zhì)空間的氧化性的環(huán)境有利于二硫鍵的形成，而胞內(nèi)則是還原性的。 周質(zhì)空間有折疊酶DsbA和DsbC的存在，幫助蛋白正確折疊。 周質(zhì)空間很少有蛋白酶存在，不會被水解。 可以使對細(xì)胞有毒性的蛋白大量存在。 5.使用特定的菌株。 AD494, which has a mutation in thioredoxin reductase (trxB). Origami，a double mutant in thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor). 6.與可溶性partner融合表達(dá)。 7.表達(dá)目的蛋白的一個片段。> 70 kDa的蛋白在大腸桿菌中是很難表達(dá)的。 8.體外去折疊，重新折疊。 |
5樓2010-09-07 20:13:51
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