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angel_yy金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】求構(gòu)建質(zhì)粒的具體步驟 謝謝 已有4人參與
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| 剛進(jìn)入分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室對(duì)質(zhì)粒的構(gòu)建很困惑，求構(gòu)建質(zhì)粒的具體步驟 謝謝 |
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dhd997(金幣+2):熱心蟲友，謝謝交流。 2010-10-12 21:54:36
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那哥哥就拿自己怎么重組一個(gè)質(zhì)粒來(lái)說(shuō)說(shuō)！ 構(gòu)建質(zhì)粒大體有兩種形式，一是加啟動(dòng)子，二是加基因序列 我之前做的是給一個(gè)空質(zhì)粒（無(wú)啟動(dòng)子）加上一個(gè)自己做的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子序列是來(lái)自青魚的b-actin基因的調(diào)控序列，這個(gè)序列已經(jīng)被提交到NCBI上的，所以找到引物（肯定有文章，因?yàn)橐呀?jīng)提交了），要不設(shè)計(jì)一個(gè)引物（因?yàn)橛行蛄辛�，很好設(shè)計(jì)，有軟件，或者找公司設(shè)計(jì)），從引物到PCR就不用說(shuō)了吧，把這段序列摳出來(lái)�。ㄔ俨逡痪�，把酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)進(jìn)引物的兩端，后面詳細(xì)） 既然是空質(zhì)粒，那么在基因（一般是標(biāo)記基因GFP/EGFP，用來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子效果）的前面肯定有酶切位點(diǎn)，就是前面說(shuō)到的酶切位點(diǎn)，順序不能搞反 這樣，把PCR出來(lái)的片段（兩段已經(jīng)有酶切位點(diǎn)序列了）和空載質(zhì)粒同時(shí)用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切，那么都具有粘性末端了，在把具有粘性末端的質(zhì)粒（線性的了，被切開了）和PCR片段混合加酶鏈接，組裝成你需要的質(zhì)粒��！OK 效率很低的，得到的重組質(zhì)粒當(dāng)然很少，再把得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，使其大量的復(fù)制（擴(kuò)大培養(yǎng)），然后你提取菌液里的質(zhì)粒，檢測(cè)，留種！OK啦 再不清晰的，M我吧 |
7樓2010-10-12 21:44:20
angel_yy
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8樓2010-10-13 23:17:48
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