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angel_yy金蟲 (正式寫手)
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[交流]
【求助/交流】求構建質(zhì)粒的具體步驟 謝謝 已有4人參與
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| 剛進入分子生物學實驗室對質(zhì)粒的構建很困惑，求構建質(zhì)粒的具體步驟 謝謝 |
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D-frank
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feiye2214
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖交流
dhd997(金幣+2):熱心蟲友，謝謝交流。 2010-10-12 21:54:36
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dhd997(金幣+2):熱心蟲友，謝謝交流。 2010-10-12 21:54:36
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那哥哥就拿自己怎么重組一個質(zhì)粒來說說！ 構建質(zhì)粒大體有兩種形式，一是加啟動子，二是加基因序列 我之前做的是給一個空質(zhì)粒（無啟動子）加上一個自己做的啟動子，啟動子序列是來自青魚的b-actin基因的調(diào)控序列，這個序列已經(jīng)被提交到NCBI上的，所以找到引物（肯定有文章，因為已經(jīng)提交了），要不設計一個引物（因為有序列了，很好設計，有軟件，或者找公司設計），從引物到PCR就不用說了吧，把這段序列摳出來�。ㄔ俨逡痪�，把酶切位點設計進引物的兩端，后面詳細） 既然是空質(zhì)粒，那么在基因（一般是標記基因GFP/EGFP，用來檢測啟動子效果）的前面肯定有酶切位點，就是前面說到的酶切位點，順序不能搞反 這樣，把PCR出來的片段（兩段已經(jīng)有酶切位點序列了）和空載質(zhì)粒同時用相應的內(nèi)切酶酶切，那么都具有粘性末端了，在把具有粘性末端的質(zhì)粒（線性的了，被切開了）和PCR片段混合加酶鏈接，組裝成你需要的質(zhì)粒�。K 效率很低的，得到的重組質(zhì)粒當然很少，再把得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進大腸桿菌感受態(tài)細胞中，使其大量的復制（擴大培養(yǎng)），然后你提取菌液里的質(zhì)粒，檢測，留種！OK啦 再不清晰的，M我吧 |
7樓2010-10-12 21:44:20
angel_yy
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8樓2010-10-13 23:17:48
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