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[交流]
【求助/交流】熱不對(duì)稱PCR的問題，回帖就送金幣！！多謝幫忙回答的，幫頂?shù)模。? 已有12人參與
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首先，熱不對(duì)稱PCR的好處是什么？它主要用來擴(kuò)已知序列的旁側(cè)基因，然后通過 一步步提高退火溫度，最后達(dá)到P出一條帶的目的。這樣理解對(duì)嗎？ 其次，我現(xiàn)在做啟動(dòng)子的染色體步移，加了接頭后。試劑盒也是推薦用熱不對(duì)稱PCR。但這時(shí)我知道我的接頭序列，又知道我的已知序列，完全可以用普通PCR擴(kuò)嘛。這樣想對(duì)嗎？ 還有，不太理解接頭引物AP和特異性引物GSP之間在片段長(zhǎng)度和退火上的差異。試劑盒上的：AP1:22個(gè)堿基 51度退火 AP2:19， 57度 。而建議我的GSP：25~28個(gè)堿基， 退火和GC和AP差不多。為什么堿基數(shù)差那么多？ 最后，2步法PCR（94度,64度）和3步法（94，退火，72度）有什么區(qū)別？好處是？ 大家一起來討論下這四個(gè)問題吧！！多謝了~~~謝謝�。。�！ 回帖就有金幣，每人可領(lǐng)5次��！ |
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
silicare(金幣+2):謝謝參與 2010-10-18 11:46:52
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silicare(金幣+2):謝謝參與 2010-10-18 11:46:52
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樓上的太不厚道了，我說一下我的想法，呵呵 第一，你所說的熱不對(duì)稱PCR實(shí)際上是TOUCHDOWN PCR的逆過程，這是在模板量較少或這是引物與模板親和力較弱時(shí)使用的，目的是前面低溫退火經(jīng)過低特異性的擴(kuò)增獲得大量的模板，在提高退火溫度，進(jìn)行特異性高的擴(kuò)增，或得目的產(chǎn)物。 第二，普通PCR由于沒有中間的基因特異性引物，這樣就導(dǎo)致上下游引物之間的距離很長(zhǎng)，也就是PCR的產(chǎn)物片段太長(zhǎng)，從而使PCR得保真度降低，效率降低。所以在普通PCR的上下游引物之間加上GSP縮短的產(chǎn)物長(zhǎng)度。 第三，解釋不清楚，可以查一下Tm值除了GC含量外，還有其他的影響因素沒。 第四，兩步法PCR節(jié)約了時(shí)間，同時(shí)提高了退火溫度，增加了特異性。 以上僅為個(gè)人己見，有不妥之處，望各為蟲友指正，見諒。謝謝！ |
38樓2010-10-18 11:28:09
taigongzaici
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2樓2010-10-17 18:56:14
liyanchunk
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3樓2010-10-17 19:08:53
liyanchunk
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4樓2010-10-17 19:09:06
liyanchunk
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5樓2010-10-17 19:09:19
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