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[交流] 【求助/交流】PCR求助，做不出來找不到原因已有4人參與

做了兩個多周的PCR了，非常郁悶。是以霉菌基因組為模板做PCR的。共設(shè)計了四對引物，PCR三個基因。（其中有一對引物是PCR基因加上它上下游的）。發(fā)現(xiàn)都沒有目的帶。

1，模板質(zhì)量應(yīng)該沒問題，跑過電泳，電泳大小在12K左右；OD600：OD800=1.81
2，引物設(shè)計，用Primer Premier設(shè)計的，有三組引物得分很高，與模板配對的引物長度為17~~20bp
3，PCR酶，DNTP，buffer沒問題。用其他模板引物做過陽性對照，所以PCR得不到目的片段肯定是模板或引物的問題。

PCR產(chǎn)物雜帶很多，曾經(jīng)對大小差不多的條帶回收酶切驗證，仍然得不到目的基因。是不是還是引物的問題？我應(yīng)該如何設(shè)計下一階段的實驗方案？

謝謝！

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1樓 2010-10-26 09:22:02

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amilie030312

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dhd997(金幣+1):鼓勵交流。 2010-10-26 10:55:09

前面很亂，也沒理出頭緒，但是雜帶很多肯定是溫度不對了，先升高溫度看看，如果是彌散的那種那可能是模板濃度太大了

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2樓2010-10-26 09:51:53

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yixuanwin

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dhd997(金幣+1):鼓勵交流。 2010-10-26 10:55:24

1 用已知序列設(shè)計引物還是近緣序列設(shè)計引物

2 不同pcr退火溫度 dntp用量延伸溫度都不一樣。你的對照如何做的。

3 既然有序列報道嘗試用報道序列提供的引物

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3樓2010-10-26 09:57:03

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Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 09:51:53:
前面很亂，也沒理出頭緒，但是雜帶很多肯定是溫度不對了，先升高溫度看看，如果是彌散的那種那可能是模板濃度太大了

謝謝！

做過溫度梯度和模板濃度梯度。
溫度再高就P不出了，
模板濃度稀釋后，影響不大，目的帶大小的條帶還是很弱，雜帶還是很多。

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4樓2010-10-26 10:32:30

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Originally posted by yixuanwin at 2010-10-26 09:57:03:
1 用已知序列設(shè)計引物還是近緣序列設(shè)計引物

2 不同pcr退火溫度 dntp用量延伸溫度都不一樣。你的對照如何做的。

3 既然有序列報道嘗試用報道序列提供的引物

謝謝！
1，已知序列
2，以TM值低5℃開始，2℃為梯度，做過退火溫度梯度；用的是Takara 的pyrobest，20ul體系用1.6ul dntp；延伸溫度是72℃。做過模板濃度的摸索。對照是用大腸基因組和相應(yīng)引物做的，PCR體系應(yīng)該沒問題。
3，這個基因是基因組分析時預(yù)測的基因，文獻(xiàn)報導(dǎo)還沒有人P過。

非常感謝您的熱心解答！

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5樓2010-10-26 10:36:40

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1949stone(金幣+2):是的有道理 2010-10-26 18:55:11

那肯定是引物不行了，如果有經(jīng)過證實的引物了那就用現(xiàn)成的吧。只需要摸摸退火溫度就行了。

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6樓2010-10-26 10:48:04

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Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 10:48:04:
那肯定是引物不行了，如果有經(jīng)過證實的引物了那就用現(xiàn)成的吧。只需要摸摸退火溫度就行了。

我再訂別的引物試試。
菌種是別人給我的，我懷疑是不是菌種給錯了啊，四個引物都P不出來。

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7樓2010-10-26 11:00:28

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Originally posted by ap at 2010-10-26 11:00:28:

我再訂別的引物試試。
菌種是別人給我的，我懷疑是不是菌種給錯了啊，四個引物都P不出來。

菌給錯了的可能性不大吧，這樣就太神奇了

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8樓2010-10-26 12:11:08

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Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 12:11:08:

菌給錯了的可能性不大吧，這樣就太神奇了

以前設(shè)計的引物是用Primer premier5設(shè)計的，得分都挺高啊�？墒蔷褪请s帶很多，沒有目的帶

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9樓2010-10-26 12:49:15

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Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 12:11:08:

菌給錯了的可能性不大吧，這樣就太神奇了

因為我的目的基因的序列的原因，卡著我的目的基因設(shè)計引物，得分都很低。我想在目的基因上下游設(shè)計引物，得到“目的基因+上下游片段”后，再以它為模板PCR這樣可行嗎？

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10樓2010-10-26 12:58:35

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