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kakaqa銅蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】有關(guān)克隆方面的問題 已有4人參與
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本人在做兩個(gè)基因的克隆，使用Takara的EXtaq擴(kuò)增出了DNA全長(zhǎng)，分別為1800bp和3000bp左右，使用pMD18-T載體做T-A克隆。 1800bp左右的菌液PCR得到了和我目的條帶一致的條帶，送樣測(cè)序結(jié)果找不到引物，經(jīng)過BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)根本不是我要的目的條帶，很困惑，為什么測(cè)序的結(jié)果找不到引物呢，是不是因?yàn)闆]連接上�；蛘呤俏腋揪蜎]擴(kuò)出目的條帶？可是測(cè)序結(jié)果總要找到引物啊。我的連接體系是1μl載體，4μlDNA, 5μl SoulutionⅠ，16℃連接了1天，按道理來說1800bp左右的片段連接過夜就可以了，為什么1天了也連接不上啊。 另外想問一下3000bp的片段takara的載體不是很好連啊，我都做了2次了，都是沒有結(jié)果，郁悶死了，哪位高手能提供點(diǎn)意見啊。 |
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2樓2010-11-03 23:27:13
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dhd997(金幣+3):good 2010-11-04 18:30:35
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dhd997(金幣+3):good 2010-11-04 18:30:35
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發(fā)表下看法： 1、不建議用EXtaq，這個(gè)酶擴(kuò)短點(diǎn)兒的片段還行，1000bp以上就會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)配了，即使連上了也沒法用，找個(gè)pfu系列的高保真酶擴(kuò)吧，我用takara公司的primerstar酶擴(kuò)3000bp沒有錯(cuò)配或缺失，建議你用這個(gè) 2、1800bp連T載體效率已經(jīng)很低了，3000bp連的話基本靠運(yùn)氣，成功率極低，不過你可以不斷的試，直到連上為止。建議你分成2段來擴(kuò)，分別連到T載體上，測(cè)序成功后再連到一起，這樣把握大些。 3、PCR時(shí)退火溫度高些較好，沒有非特異的雜帶，另外操作時(shí)盡量要嚴(yán)謹(jǐn)，避免出現(xiàn)不明的現(xiàn)象。 |
4樓2010-11-04 15:44:21
friend.11
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5樓2010-11-04 19:33:09
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