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[交流] 【求助/交流】酶切位點重合了的兩個酶的酶切問題已有2人參與

各位高手，我現(xiàn)在要做一個基因的克隆，上游引物只能用NcoI，下游只能用BamHI，但是在載體上這兩個酶的酶切位點是重合的，切了一個另外一個就不能切了，應該怎么辦��？

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【專題】引入酶切位點的引物設計問題已經(jīng)有11人回復

1樓 2010-11-05 17:59:42

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恒星年

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怎么沒人進來啊？自己頂個先

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2樓2010-11-05 18:35:08

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hnndpt

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恒星年(金幣+1):謝謝，但是應該是有辦法解決的 2010-11-05 19:03:38

估計得重新構建載體了

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3樓2010-11-05 18:51:15

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估計得重新構建載體了

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4樓2010-11-05 18:51:27

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susizheng

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恒星年(金幣+1):謝謝，由于特殊要求所以不能單切啊 2010-11-09 10:28:20

單酶切連接了。

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Thank-you，so-blue.

5樓2010-11-08 12:16:51

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空谷幽風

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恒星年(金幣+2):謝謝，我去學習下這個方法怎么用，呵呵 2010-11-09 10:29:36

引用回帖:

Originally posted by susizheng at 2010-11-08 12:16:51:
單酶切連接了。

他設計的雙酶切連接，你覺得單酶切連接的方案能行嗎？
樓主有沒有做過重組，就是設兩條帶重組臂的上下游引物，重新擴片段，載體經(jīng)單酶切后把片段用重組酶重組到目標載體那

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

6樓2010-11-08 13:15:22

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shuxian1

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估計得重新設計引物了

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我與你一起闖天下

7樓2010-11-08 14:09:31

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susizheng

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scelab(金幣+3):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-11-08 23:06:22
恒星年(金幣+1):謝謝 2010-11-09 10:31:03

引用回帖:

Originally posted by 空谷幽風 at 2010-11-08 13:15:22:

他設計的雙酶切連接，你覺得單酶切連接的方案能行嗎？
樓主有沒有做過重組，就是設兩條帶重組臂的上下游引物，重新擴片段，載體經(jīng)單酶切后把片段用重組酶重組到目標載體那

單酶切連接還是比較成熟和傳統(tǒng)得方法的，載體用堿性磷酸酶處理下，以減少自連。
你所說的用同源重組的方法，不知道是不是SLIC，其實很多這種方法文獻來源影響因子倒是挺高的，但是可行性和成功率沒有他們吹噓的那樣好。個人感覺還是傳統(tǒng)得方法保險。

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Thank-you，so-blue.

8樓2010-11-08 15:44:38

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amilie030312

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scelab(金幣+2):歡迎多來交流！:tiger06: 2010-11-08 23:06:39
恒星年(金幣+1):謝謝，這樣的話NcoI就是平末端了 2010-11-09 10:30:14

是否可以先切NcoI，用酶補平之后再加幾個堿基在前面，再切BamhI，不知道這樣是否可行，非要切這樣可以試試，能不能做出來就不知道了

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9樓2010-11-08 16:00:52

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reasonspare(金幣+2):眼睛要保護 2010-11-10 10:37:34

引用回帖:

Originally posted by amilie030312 at 2010-11-08 16:00:52:
是否可以先切NcoI，用酶補平之后再加幾個堿基在前面，再切BamHI，不知道這樣是否可行，非要切這樣可以試試，能不能做出來就不知道了

此方法不可行，NcoI單酶切完了之后進行補平，把剛產(chǎn)生的NcoI的粘性末端也補平了，之后用BamHI確實有可能切開，但得不到NotI的粘性末端

[ Last edited by 空谷幽風 on 2010-11-8 at 17:13 ]

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

10樓2010-11-08 17:05:42

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