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maxwell1988金蟲 (小有名氣)
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[交流]
【求助/交流】關(guān)于酶切產(chǎn)物連接的一點(diǎn)問題 已有5人參與
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最近在做重組基因的連接，但是連了好幾次就是連不上。具體是這樣的，希望高手幫忙答疑解惑下： 基因(~0.5kb)是單酶切，載體(~5kb)是雙酶切，20μl體系，基因載體按摩爾比算的體積比： 基因 2μl 載體 9μl buffer 2μl PDG 2μl T4連接酶 5μl 22℃，16h。 之后就是常規(guī)的轉(zhuǎn)化了，菌落PCR，單酶切鑒定后發(fā)現(xiàn)條帶的大小不對(duì)，宣告連接失敗。  要命的是做了好幾次，甚至有次還做了基因載體比例的梯度連接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果還是以失敗告終。我想知道問題可能出在了什么地方，有什么地方可以改進(jìn)的，望各位大俠們不比吝賜教�。�！ |
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+5):全面，細(xì)心 2010-11-19 10:44:48
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lstt09nk(金幣+5):全面，細(xì)心 2010-11-19 10:44:48
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1、連接片段和載體的比例，不是按照ul來計(jì)算，是數(shù)量比，mol數(shù)�。�！ 2、500bp的片段連接載體是不成問題的。關(guān)鍵在于：切出來的末端是否和載體的缺刻正好相對(duì)？ 3、不知道你的切點(diǎn)是平末端還是粘末端？前者是否需要脫磷處理，以提高連接效率？ 4、不知用的是哪個(gè)公司的產(chǎn)品，檢查是否過期等。連接酶5uL？？？這是帶buffer嗎？如果不是，是不是濃度太高了？甘油就能夠完全抑制活性了。 5、22℃連接16h是否太長(zhǎng)了？我經(jīng)常用到的是4℃，2天； 16℃，30-50min； 22℃，2-5h…… 6、建議按照說明書來做，做前仔細(xì)計(jì)算好體系，到底加多少！酶切的產(chǎn)物是否純化了？純化后溶解液是什么？是否檢測(cè)濃度了？酶切后的載體是否存在自連？？ 多數(shù)以反問的形式回答樓主，希望能有幫助。 |
2樓2010-11-19 10:23:35
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