 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1981 | 回復(fù): 13 | |||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | |||
maxwell1988金蟲 (小有名氣)
|
[交流]
【求助/交流】關(guān)于酶切產(chǎn)物連接的一點(diǎn)問題 已有5人參與
|
||
|
最近在做重組基因的連接，但是連了好幾次就是連不上。具體是這樣的，希望高手幫忙答疑解惑下： 基因(~0.5kb)是單酶切，載體(~5kb)是雙酶切，20μl體系，基因載體按摩爾比算的體積比： 基因 2μl 載體 9μl buffer 2μl PDG 2μl T4連接酶 5μl 22℃，16h。 之后就是常規(guī)的轉(zhuǎn)化了，菌落PCR，單酶切鑒定后發(fā)現(xiàn)條帶的大小不對(duì)，宣告連接失敗。  要命的是做了好幾次，甚至有次還做了基因載體比例的梯度連接實(shí)驗(yàn)，結(jié)果還是以失敗告終。我想知道問題可能出在了什么地方，有什么地方可以改進(jìn)的，望各位大俠們不比吝賜教�。�！ |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：實(shí)驗(yàn)器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)中的趣事：和實(shí)驗(yàn)材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有283人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 基因克隆中酶切連接問題
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 單酶切連接的問題
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 連接酶切問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 單酶切，酶連之后驗(yàn)證問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 雙酶切連接表達(dá)載體，兩個(gè)月都沒做出來，問題到底出在哪里呢~？求指點(diǎn)
已經(jīng)有52人回復(fù)
- 【求助/交流】單酶切酶和DNA的比例，體系大小的問題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】質(zhì)粒雙酶切連接問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于酶切連接轉(zhuǎn)化的問題
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】酶切連接后的分子大小問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
yzuxhq368
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1001.1
- 散金: 175
- 紅花: 7
- 帖子: 129
- 在線: 64.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 448251
- 注冊(cè): 2007-11-01
9樓2010-11-20 23:01:11
zhwenxing
木蟲 (著名寫手)
尛森蟲
- 應(yīng)助: 11 (小學(xué)生)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 2189.8
- 散金: 50
- 紅花: 2
- 帖子: 1324
- 在線: 93.3小時(shí)
- 蟲號(hào): 596551
- 注冊(cè): 2008-09-09
- 專業(yè): 疫苗學(xué)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+5):全面，細(xì)心 2010-11-19 10:44:48
小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流
lstt09nk(金幣+5):全面，細(xì)心 2010-11-19 10:44:48
|
1、連接片段和載體的比例，不是按照ul來計(jì)算，是數(shù)量比，mol數(shù)�。�！ 2、500bp的片段連接載體是不成問題的。關(guān)鍵在于：切出來的末端是否和載體的缺刻正好相對(duì)？ 3、不知道你的切點(diǎn)是平末端還是粘末端？前者是否需要脫磷處理，以提高連接效率？ 4、不知用的是哪個(gè)公司的產(chǎn)品，檢查是否過期等。連接酶5uL？？？這是帶buffer嗎？如果不是，是不是濃度太高了？甘油就能夠完全抑制活性了。 5、22℃連接16h是否太長了？我經(jīng)常用到的是4℃，2天； 16℃，30-50min； 22℃，2-5h…… 6、建議按照說明書來做，做前仔細(xì)計(jì)算好體系，到底加多少！酶切的產(chǎn)物是否純化了？純化后溶解液是什么？是否檢測濃度了？酶切后的載體是否存在自連？？ 多數(shù)以反問的形式回答樓主，希望能有幫助。 |
2樓2010-11-19 10:23:35
skkyy88888
銅蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 5 (幼兒園)
- 金幣: 142
- 散金: 1521
- 紅花: 1
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 2340
- 在線: 216.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 277762
- 注冊(cè): 2006-09-09
- 專業(yè): 生物化學(xué)
3樓2010-11-19 12:11:46
zgb1982
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 46 (小學(xué)生)
- 金幣: 2895.3
- 紅花: 3
- 帖子: 536
- 在線: 227.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 664342
- 注冊(cè): 2008-11-29
- 專業(yè): 植物病理學(xué)
4樓2010-11-19 13:22:15
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +4 | 睿08 2026-03-17 | 6/300 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿中國海洋大學(xué)，生物學(xué)，301分，求調(diào)劑 +3 | 1孫悟空 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +5 | 大口吃飯 身體健 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 341求調(diào)劑 +5 | 搗蛋豬豬 2026-03-11 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，總分315，考的生物醫(yī)藥，一志愿湖南師范大學(xué)。調(diào)劑到任何專業(yè)都可以 +4 | 小丁想進(jìn)步 2026-03-11 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +6 | 步川酷紫123 2026-03-11 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 材料專碩274一志愿陜西師范大學(xué)求調(diào)劑 +5 | 薛云鵬 2026-03-13 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +4 | ahbd 2026-03-14 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085600調(diào)劑 +5 | 漾漾123sun 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 297一志愿上交085600求調(diào)劑 +5 | 指尖八千里 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑 +4 | 威化餅07 2026-03-12 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈工大材料324分求調(diào)劑 +5 | 閆旭東 2026-03-14 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 331求調(diào)劑（0703有機(jī)化學(xué) +5 | ZY-05 2026-03-13 | 6/300 |
|
|
|
[考研] ［0860］321分求調(diào)劑，ab區(qū)皆可 +4 | 寶貴熱 2026-03-13 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 333求調(diào)劑 +3 | 球球古力 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 【考研調(diào)劑求收留】 +3 | Ceciilia 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 0703化學(xué)求調(diào)劑 +7 | 綠豆芹菜湯 2026-03-12 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求b區(qū)學(xué)校調(diào)劑 +3 | 周56 2026-03-11 | 3/150 |
|
|
|
[論文投稿]
投稿問題
 5+4
|
星光燦爛xt 2026-03-12 | 6/300 |
|