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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告
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richenim

金蟲 (小有名氣)

[交流] 【求助/交流】AnnexinV/PI雙染檢測凋亡細(xì)胞，結(jié)果“詭異”，求幫助！

最近在做AnnexinV/PI雙染檢測凋亡細(xì)胞，用的是凱基生物的AnnexinV/PI試劑盒，細(xì)胞給藥24小時(shí)后，有70%都變圓收縮，還有20-30%都漂了起來，但是用流式檢測凋亡的結(jié)果卻只有百分之幾而已，請高手幫我解答下這是為什么�。�
PS:本人之前還做了hochest33342和DNA Ladder，結(jié)果都顯示我的藥是有促凋亡作用的。
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細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作 流式

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richenim(金幣+5): 2010-12-10 11:39:54
dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:59
如果你確定是有凋亡，那么我覺得應(yīng)該是你制備的問題

這是我們實(shí)驗(yàn)室的制備方法


流式細(xì)胞術(shù)雙染測凋亡的樣品制備

1、        將各組細(xì)胞的培養(yǎng)基移入15ml離心管，加終濃度為2%的BSA。
2、        用胰酶消化細(xì)胞，吸除胰酶，加原培養(yǎng)基小心吹打成單細(xì)胞。
3、        1500rpm離心5min，棄盡上清。用室溫平衡的PBS 1ml重懸細(xì)胞，小心吹打。

另外，你的細(xì)胞數(shù)也太少了吧，才剛剛好4次方的細(xì)胞，做流式一般要5次方個(gè)細(xì)胞才可信（當(dāng)然有可能是按百分之多少顯示）
7樓2010-12-10 11:24:51
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richenim(金幣+5): 2010-12-10 11:39:23
dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:38
我們實(shí)驗(yàn)室用凱基的雙染試劑盒就是沒做出來，后來換了Trevigen的（和R&D搞貼牌的）就做出來了~

另外要考慮制備的問題，是不是制備的時(shí)候損失了很多細(xì)胞
還有就是有沒有注意用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞
如果用了EDTA的胰酶，有沒有PBS洗
還有檢測的時(shí)候有沒有注意時(shí)間，以及避光等
2樓2010-12-10 10:35:38
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richenim

金蟲 (小有名氣)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 10:35:38:
我們實(shí)驗(yàn)室用凱基的雙染試劑盒就是沒做出來，后來換了Trevigen的（和R&D搞貼牌的）就做出來了~

另外要考慮制備的問題，是不是制備的時(shí)候損失了很多細(xì)胞
還有就是有沒有注意用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞
如果用 ...

我送檢的地方都是用的凱基生物的哦，別人都可以做出來哦！
給藥時(shí)間到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心1000rpm，5min，再用PBS洗兩次，再將細(xì)胞保存在PBS里面，拿去檢測。（我從學(xué)校到送檢的地方有兩個(gè)小時(shí)，兩個(gè)小時(shí)中細(xì)胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道這個(gè)時(shí)間的耽誤有沒有問題哦！）
3樓2010-12-10 11:06:36
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上圖吧……結(jié)合圖片給你做分析。而且我做的方法跟你的有點(diǎn)點(diǎn)不一樣
4樓2010-12-10 11:09:37
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richenim

金蟲 (小有名氣)
5樓2010-12-10 11:17:48
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richenim

金蟲 (小有名氣)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 11:09:37:
上圖吧……結(jié)合圖片給你做分析。而且我做的方法跟你的有點(diǎn)點(diǎn)不一樣

你做的和我哪里有點(diǎn)點(diǎn)不一樣哦？
6樓2010-12-10 11:18:43
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另外，如果細(xì)胞比較脆，在離心前先37℃孵育幾分鐘
8樓2010-12-10 11:26:03
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richenim

金蟲 (小有名氣)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 11:24:51:
如果你確定是有凋亡，那么我覺得應(yīng)該是你制備的問題

這是我們實(shí)驗(yàn)室的制備方法


流式細(xì)胞術(shù)雙染測凋亡的樣品制備

1、        將各組細(xì)胞的培養(yǎng)基移入15ml離心管，加終濃度為2%的BSA。
2、        用胰酶消化細(xì)胞，吸 ...

我的細(xì)胞很多的，我是用25ml的培養(yǎng)瓶養(yǎng)的，是我拿過去的時(shí)候，那個(gè)檢測的人只取了一部分檢測的哦！
加BSA要加多少毫升��？只要是終濃度是2%就行了嗎？
我的細(xì)胞很難消化，一般要用胰酶使細(xì)胞飄起來一部分后才能完全吹打下來哦！
9樓2010-12-10 11:36:19
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richenim(金幣+5): 2010-12-10 15:27:42
rainwander(金幣+2):鼓勵(lì)積極參與~~~ 2010-12-12 00:27:53
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Originally posted by richenim at 2010-12-10 11:36:19:


我的細(xì)胞很多的，我是用25ml的培養(yǎng)瓶養(yǎng)的，是我拿過去的時(shí)候，那個(gè)檢測的人只取了一部分檢測的哦！
加BSA要加多少毫升啊？只要是終濃度是2%就行了嗎？
我的細(xì)胞很難消化，一般要用胰酶使細(xì)胞飄起來一部分后 ...

是的，終濃度2%即可
這一步是用于保護(hù)細(xì)胞的
因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞的細(xì)胞膜很脆弱，所以在制備的過程中很容易破掉，這樣離心的時(shí)候就只能收集到碎片，而碎片在上流檢測時(shí)會被截掉，導(dǎo)致假陰性
10樓2010-12-10 12:14:16
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richenim

金蟲 (小有名氣)
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 12:14:16:


是的，終濃度2%即可
這一步是用于保護(hù)細(xì)胞的
因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞的細(xì)胞膜很脆弱，所以在制備的過程中很容易破掉，這樣離心的時(shí)候就只能收集到碎片，而碎片在上流檢測時(shí)會被截掉，導(dǎo)致假陰性

非常感謝哈！
那用胰酶消化下來的細(xì)胞需要加2%BSA保護(hù)嗎？
將培養(yǎng)基中的細(xì)胞和胰酶消化下來的細(xì)胞一起收集后，需要用PBS洗滌嗎？
我將最后收集的細(xì)胞重懸在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去檢測（將裝有細(xì)胞的離心管插在冰上要好一些，還是只在冰盒里放一些冰袋就行了啊？），路途又將近兩個(gè)小時(shí)，不知道這兩個(gè)小時(shí)對檢測結(jié)果有沒有影響？
11樓2010-12-10 15:35:37
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richenim(金幣+3): 2010-12-10 18:22:52
dhd997(金幣+2):good 2010-12-11 08:38:18
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Originally posted by richenim at 2010-12-10 15:35:37:


非常感謝哈！
那用胰酶消化下來的細(xì)胞需要加2%BSA保護(hù)嗎？
將培養(yǎng)基中的細(xì)胞和胰酶消化下來的細(xì)胞一起收集后，需要用PBS洗滌嗎？
我將最后收集的細(xì)胞重懸在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去檢測（將裝有細(xì)胞的離 ...

注意到，首先我是把培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移到15ml離心管里頭，加好BSA
然后消化細(xì)胞，吸掉胰酶吹打細(xì)胞用的是原來的培養(yǎng)基
因?yàn)檫@一步要吹打成單細(xì)胞，所以需要BSA保護(hù)

細(xì)胞打散后，要離心，用PBS洗一遍，離心再用PBS重懸
12樓2010-12-10 16:33:08
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Originally posted by richenim at 2010-12-10 15:35:37:


非常感謝哈！
那用胰酶消化下來的細(xì)胞需要加2%BSA保護(hù)嗎？
將培養(yǎng)基中的細(xì)胞和胰酶消化下來的細(xì)胞一起收集后，需要用PBS洗滌嗎？
我將最后收集的細(xì)胞重懸在1mlPBS中，放在冰盒里面拿去檢測（將裝有細(xì)胞的離 ...

要插在冰上才行……2h也太久了一點(diǎn)……
13樓2010-12-10 16:34:24
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richenim

金蟲 (小有名氣)
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 16:34:24:


要插在冰上才行……2h也太久了一點(diǎn)……

恩，是的。我后來問了個(gè)老師他說兩個(gè)小時(shí)太久了，那個(gè)細(xì)胞膜都改變了，染料都染不上了哦，那可不可以直接把細(xì)胞拿過去（我用25ml的培養(yǎng)瓶養(yǎng)的細(xì)胞），拿過去后再收集細(xì)胞�。亢竺娴氖占�(xì)胞可不可以不用無菌操作哦？
14樓2010-12-11 01:04:00
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richenim(金幣+2): 2010-12-11 13:53:02
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Originally posted by richenim at 2010-12-11 01:04:00:


恩，是的。我后來問了個(gè)老師他說兩個(gè)小時(shí)太久了，那個(gè)細(xì)胞膜都改變了，染料都染不上了哦，那可不可以直接把細(xì)胞拿過去（我用25ml的培養(yǎng)瓶養(yǎng)的細(xì)胞），拿過去后再收集細(xì)胞��？后面的收集細(xì)胞可不可以不用無菌操 ...

可以。但是2個(gè)小時(shí)的運(yùn)輸，脫離的培養(yǎng)條件，可能會對你的凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生影響

可以不用無菌操作。
15樓2010-12-11 10:05:55
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richenim

金蟲 (小有名氣)
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 10:05:55:


可以。但是2個(gè)小時(shí)的運(yùn)輸，脫離的培養(yǎng)條件，可能會對你的凋亡現(xiàn)象產(chǎn)生影響

可以不用無菌操作。

現(xiàn)在也只有試試了哦！
我想問下你做周期是不是要先將細(xì)胞饑餓了使之同步化了再給藥刺激哦！要饑餓多久才行�。孔詈笥靡掖脊潭ǖ臅r(shí)候，我查資料有70%、75%和95%乙醇，那到底用那一種哦？
16樓2010-12-11 13:56:47
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richenim(金幣+10): 2010-12-11 22:27:20
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Originally posted by richenim at 2010-12-11 13:56:47:

現(xiàn)在也只有試試了哦！
我想問下你做周期是不是要先將細(xì)胞饑餓了使之同步化了再給藥刺激哦！要饑餓多久才行�。孔詈笥靡掖脊潭ǖ臅r(shí)候，我查資料有70%、75%和95%乙醇，那到底用那一種哦？

看情況，我不習(xí)慣做同步化。如果做不出陽性結(jié)果再試試同步化

我們實(shí)驗(yàn)室的protocol

流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期樣品制備

1、        消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，并用中槍充分吹打成單細(xì)胞懸液。
2、        1000~1500rpm離心5min，棄盡上清，加500ul PBS輕柔重懸。
3、        緩慢加入1.5ml無水乙醇，邊加邊搖勻。
4、        置4℃固定過夜。
5、        同法離心，去除乙醇。避光條件下加500ul PI染液重懸，移入流式管。
17樓2010-12-11 15:30:23
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richenim

金蟲 (小有名氣)
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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 15:30:23:


看情況，我不習(xí)慣做同步化。如果做不出陽性結(jié)果再試試同步化

我們實(shí)驗(yàn)室的protocol

流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期樣品制備

1、        消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，并用中槍充分吹打成單細(xì)胞懸液。
2、        1000~1500 ...

1、做不出陽性結(jié)果？怎樣才是陽性結(jié)果��？是前面要有亞二倍體峰嗎？
2、懸浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞要收集不？離心得到細(xì)胞后腰用PBS洗滌不？
3、緩慢加入1.5ml無水乙醇，邊加邊搖勻，加完后還需要用槍吹打混勻不？
4、固定后腰在多久時(shí)間內(nèi)檢測�。�
18樓2010-12-11 22:38:49
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Originally posted by richenim at 2010-12-11 22:38:49:

1、做不出陽性結(jié)果？怎樣才是陽性結(jié)果啊？是前面要有亞二倍體峰嗎？
2、懸浮在培養(yǎng)基中的細(xì)胞要收集不？離心得到細(xì)胞后腰用PBS洗滌不？
3、緩慢加入1.5ml無水乙醇，邊加邊搖勻，加完后還需要用槍吹打混勻不？ ...

哈，我以為你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我們從來不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M時(shí)期的，那可能根本就觀察不到sub G1，這個(gè)方法假陰性極高。而且不懂的人把碎片峰當(dāng)sub G1看了，貽笑大方……
19樓2010-12-11 23:26:22
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richenim

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 23:26:22:


哈，我以為你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我們從來不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M時(shí)期的，那可能根本就觀察不到sub G1，這個(gè)方法假陰性極高。而且不懂的人把碎片峰當(dāng)sub G1看了，貽笑大 ...

哦，原來是這樣��！我剛做了一個(gè)周期，結(jié)果是G2/M時(shí)期依賴性增加，但沒有sub G0/G1期的峰出現(xiàn)，但我看的外文文獻(xiàn)上面幾乎都有這個(gè)sub G0/G1期哦！
20樓2010-12-12 23:35:45
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shadowfly

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細(xì)胞為什么要放冰盒里呢？按說直接揣過去就好，損傷多
21樓2010-12-13 00:11:49
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Originally posted by richenim at 2010-12-12 23:35:45:

哦，原來是這樣��！我剛做了一個(gè)周期，結(jié)果是G2/M時(shí)期依賴性增加，但沒有sub G0/G1期的峰出現(xiàn)，但我看的外文文獻(xiàn)上面幾乎都有這個(gè)sub G0/G1期哦！

我不知道你看什么檔次的文獻(xiàn)哦~反正這個(gè)技術(shù)是絕對會被淘汰的
22樓2010-12-13 10:25:57
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richenim

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Originally posted by shadowfly at 2010-12-13 00:11:49:
細(xì)胞為什么要放冰盒里呢？按說直接揣過去就好，損傷多

直接揣過去的話也能承受兩個(gè)小時(shí)的路途嗎？你是說收集的細(xì)胞直接揣過去嗎？
23樓2010-12-13 12:47:27
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richenim

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Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-13 10:25:57:


我不知道你看什么檔次的文獻(xiàn)哦~反正這個(gè)技術(shù)是絕對會被淘汰的

還有個(gè)問題需要請教你下哦！
做細(xì)胞周期，細(xì)胞固定后可以放置多久��？我的樣品還比較多的，我想分幾批做了后一起拿過去，這樣的話就有些固定了的細(xì)胞要放置比較長時(shí)間（大概一個(gè)星期左右吧），不知道可行不？
24樓2010-12-14 15:55:33
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Originally posted by richenim at 2010-12-14 15:55:33:


還有個(gè)問題需要請教你下哦！
做細(xì)胞周期，細(xì)胞固定后可以放置多久��？我的樣品還比較多的，我想分幾批做了后一起拿過去，這樣的話就有些固定了的細(xì)胞要放置比較長時(shí)間（大概一個(gè)星期左右吧），不知道可行不？

沒試過這么久，一般固定過夜
25樓2010-12-14 16:47:16
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richenim

金蟲 (小有名氣)
引用回帖:
19樓: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-11 23:26:22:
哈，我以為你是做周期……不是做凋亡

sub G1法我們從來不用，如果是S phase dependent的凋亡或者G2/M時(shí)期的，那可能根本就觀察不到sub G1，這個(gè)方法假陰性極高。而且不懂的人把碎片峰當(dāng)sub G1看了，貽笑大 ...

我想請教下你，現(xiàn)在我的文章投出去后有了審稿意見，其中有個(gè)審稿人就指出我的細(xì)胞周期分布圖上面為什么沒有sub-G1峰哦，我該怎么回復(fù)呢？
PS：細(xì)胞周期分布我是用PI單染做的，結(jié)果是細(xì)胞周期阻滯在G2/M期；流式雙染的細(xì)胞凋亡率為20％(誘導(dǎo)24h)，DNA Ladder的結(jié)果是在24h檢測，Ladder現(xiàn)象看不到，但作用36h后Ladder現(xiàn)象很明顯��！

謝謝了哈！
26樓2011-09-16 14:21:06
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hallen6891

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
細(xì)胞數(shù)目應(yīng)該是足夠了的，我一般做凋亡收1萬或者2萬個(gè)細(xì)胞都可以做，結(jié)果都是很好的，而且我收細(xì)胞的時(shí)候都是用2000rpm收集的，就像三磷酸腺苷說的那樣，應(yīng)該是樣品制備存在一定的問題。
27樓2012-11-29 16:26:48
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yu321chao

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904901樓: Originally posted by richenim at 2010-12-14 15:55:33
還有個(gè)問題需要請教你下哦！
做細(xì)胞周期，細(xì)胞固定后可以放置多久��？我的樣品還比較多的，我想分幾批做了后一起拿過去，這樣的話就有些固定了的細(xì)胞要放置比較長時(shí)間（大概一個(gè)星期左右吧），不知道可行不？...

你好，我想請教一個(gè)問題，我測凋亡的時(shí)候，圖上面顯示的點(diǎn)群只是出現(xiàn)平移，沒有出現(xiàn)兩組點(diǎn)群是怎么回事��？求教~~
28樓2012-12-21 21:01:45
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hgh99618

金蟲 (正式寫手)
★
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這是一個(gè)很有意思的問題。你已經(jīng)知道你用的藥物能誘導(dǎo)凋亡，那就應(yīng)該能做出來。除了以上樓主所說的原因，還有：細(xì)胞不能太少，因?yàn)槟愕乃幬镎T導(dǎo)凋亡后--你介紹的20-30%的細(xì)胞漂浮起來，說明有大量細(xì)胞死亡。另外，在收獲細(xì)胞時(shí)，要注意不要離心時(shí)間太長、轉(zhuǎn)數(shù)不要高。還有，你說2小時(shí)后送檢，如果是加了熒光試劑，2小時(shí)就衰減很多了，再延長時(shí)間久明顯減少熒光細(xì)胞的數(shù)量。不知你怎么看？
29樓2012-12-21 22:57:39
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ququ1105

銀蟲 (小有名氣)
★
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細(xì)胞凋亡用無EDTA的胰酶消化。
你的離心速度有多少，飄起來的細(xì)胞是否都收集了進(jìn)去？別使勁吹細(xì)胞，怕把細(xì)胞吹壞，用手彈。
上流式時(shí)圈門的時(shí)候是不是外面有很多死細(xì)胞？這些已經(jīng)死了的沒有圈進(jìn)去的話，也可能造成圖里沒有顯示。
是到了老師那里才染得色吧？我覺得請教一下測流式的老師為好。
不要用太多的液體重懸，流式200ul就夠了，但是細(xì)胞數(shù)目控制好，不要太多，多了染色染不上。
細(xì)胞固定理論上一個(gè)月都是沒有問題的，一個(gè)星期完全可以。
30樓2013-04-04 20:16:40
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lizh736

銀蟲 (正式寫手)
★
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樓主，我也遇到跟你同樣的問題。我跟你用的是同一個(gè)牌子的燃料。也是沒有陽性結(jié)果。但是PI的信號很高。不知樓主是否解決？
31樓2013-04-10 20:40:54
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begining

木蟲 (小有名氣)
★
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引用回帖:
31樓: Originally posted by lizh736 at 2013-04-10 20:40:54
樓主，我也遇到跟你同樣的問題。我跟你用的是同一個(gè)牌子的燃料。也是沒有陽性結(jié)果。但是PI的信號很高。不知樓主是否解決？

我也出現(xiàn)同樣的問題，用的碧云天的，PI染色了，F(xiàn)ITC染不上，誤差值也很大
你的問題解決了嗎？
32樓2013-06-11 16:48:03
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xiaoleohong

銅蟲 (初入文壇)
★
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正在糾結(jié)怎么用AnneinV-GFP/PI染料做凋亡細(xì)胞檢測，能不能去請求各位前輩發(fā)下具體步驟喲？
33樓2013-06-25 20:50:44
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一旺百旺

新蟲 (著名寫手)
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引用回帖:
13樓: Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 16:34:24
要插在冰上才行……2h也太久了一點(diǎn)……...

加入染色劑后，凱基試劑盒上是說室溫，避光5-15min,那為啥還要插在冰里呢？
34樓2014-04-21 12:25:56
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yyy0305

至尊木蟲 (著名寫手)
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估計(jì)你給藥的濃度過高了，細(xì)胞都被毒死了。建議你先做個(gè)藥敏實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞的活力，看看藥物對細(xì)胞的IC50。凋亡時(shí)一個(gè)緩慢漸近的過程，凋亡早期細(xì)胞的形態(tài)不會發(fā)生發(fā)生太大的變化，70%都變圓收縮不是個(gè)正常現(xiàn)象
35樓2015-05-29 09:43:28
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_遠(yuǎn)橋

銅蟲 (初入文壇)
★
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引用回帖:
35樓: Originally posted by yyy0305 at 2015-05-29 09:43:28
估計(jì)你給藥的濃度過高了，細(xì)胞都被毒死了。建議你先做個(gè)藥敏實(shí)驗(yàn)測細(xì)胞的活力，看看藥物對細(xì)胞的IC50。凋亡時(shí)一個(gè)緩慢漸近的過程，凋亡早期細(xì)胞的形態(tài)不會發(fā)生發(fā)生太大的變化，70%都變圓收縮不是個(gè)正�，F(xiàn)象

請問凋亡實(shí)驗(yàn)中藥物濃度一般選多少比較好呢？
是IC50左右還是比IC50再小一點(diǎn)比較好？
謝謝
36樓2015-07-08 10:59:10
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Lily Li

新蟲 (初入文壇)
★
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你是不是PI沒染上，然后凋亡細(xì)胞算在壞死細(xì)胞里邊去了
37樓2016-01-19 06:26:22
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