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【求助/交流】AnnexinV/PI雙染檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果“詭異”，求幫助！
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最近在做AnnexinV/PI雙染檢測(cè)凋亡細(xì)胞，用的是凱基生物的AnnexinV/PI試劑盒，細(xì)胞給藥24小時(shí)后，有70%都變圓收縮，還有20-30%都漂了起來，但是用流式檢測(cè)凋亡的結(jié)果卻只有百分之幾而已，請(qǐng)高手幫我解答下這是為什么�。� PS:本人之前還做了hochest33342和DNA Ladder，結(jié)果都顯示我的藥是有促凋亡作用的。 |
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 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作 | 流式 |
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richenim(金幣+5): 2010-12-10 11:39:54
dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:59
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如果你確定是有凋亡，那么我覺得應(yīng)該是你制備的問題 這是我們實(shí)驗(yàn)室的制備方法 流式細(xì)胞術(shù)雙染測(cè)凋亡的樣品制備 1、 將各組細(xì)胞的培養(yǎng)基移入15ml離心管，加終濃度為2%的BSA。 2、 用胰酶消化細(xì)胞，吸除胰酶，加原培養(yǎng)基小心吹打成單細(xì)胞。 3、 1500rpm離心5min，棄盡上清。用室溫平衡的PBS 1ml重懸細(xì)胞，小心吹打。 另外，你的細(xì)胞數(shù)也太少了吧，才剛剛好4次方的細(xì)胞，做流式一般要5次方個(gè)細(xì)胞才可信（當(dāng)然有可能是按百分之多少顯示） |
7樓2010-12-10 11:24:51
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dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:38
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我們實(shí)驗(yàn)室用凱基的雙染試劑盒就是沒做出來，后來?yè)Q了Trevigen的（和R&D搞貼牌的）就做出來了~ 另外要考慮制備的問題，是不是制備的時(shí)候損失了很多細(xì)胞 還有就是有沒有注意用無EDTA的胰酶消化細(xì)胞 如果用了EDTA的胰酶，有沒有PBS洗 還有檢測(cè)的時(shí)候有沒有注意時(shí)間，以及避光等 |
2樓2010-12-10 10:35:38
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richenim(金幣+10): 2010-12-11 22:27:20
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看情況，我不習(xí)慣做同步化。如果做不出陽性結(jié)果再試試同步化 我們實(shí)驗(yàn)室的protocol 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期樣品制備 1、 消化細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸，并用中槍充分吹打成單細(xì)胞懸液。 2、 1000~1500rpm離心5min，棄盡上清，加500ul PBS輕柔重懸。 3、 緩慢加入1.5ml無水乙醇，邊加邊搖勻。 4、 置4℃固定過夜。 5、 同法離心，去除乙醇。避光條件下加500ul PI染液重懸，移入流式管。 |
17樓2010-12-11 15:30:23
18樓2010-12-11 22:38:49
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25樓2010-12-14 16:47:16
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27樓2012-11-29 16:26:48
28樓2012-12-21 21:01:45
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| 這是一個(gè)很有意思的問題。你已經(jīng)知道你用的藥物能誘導(dǎo)凋亡，那就應(yīng)該能做出來。除了以上樓主所說的原因，還有：細(xì)胞不能太少，因?yàn)槟愕乃幬镎T導(dǎo)凋亡后--你介紹的20-30%的細(xì)胞漂浮起來，說明有大量細(xì)胞死亡。另外，在收獲細(xì)胞時(shí)，要注意不要離心時(shí)間太長(zhǎng)、轉(zhuǎn)數(shù)不要高。還有，你說2小時(shí)后送檢，如果是加了熒光試劑，2小時(shí)就衰減很多了，再延長(zhǎng)時(shí)間久明顯減少熒光細(xì)胞的數(shù)量。不知你怎么看？ |
29樓2012-12-21 22:57:39
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細(xì)胞凋亡用無EDTA的胰酶消化。 你的離心速度有多少，飄起來的細(xì)胞是否都收集了進(jìn)去？別使勁吹細(xì)胞，怕把細(xì)胞吹壞，用手彈。 上流式時(shí)圈門的時(shí)候是不是外面有很多死細(xì)胞？這些已經(jīng)死了的沒有圈進(jìn)去的話，也可能造成圖里沒有顯示。 是到了老師那里才染得色吧？我覺得請(qǐng)教一下測(cè)流式的老師為好。 不要用太多的液體重懸，流式200ul就夠了，但是細(xì)胞數(shù)目控制好，不要太多，多了染色染不上。 細(xì)胞固定理論上一個(gè)月都是沒有問題的，一個(gè)星期完全可以。 |
30樓2013-04-04 20:16:40
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