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richenim

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PI雙染檢測(cè)凋亡細(xì)胞，結(jié)果“詭異”，求幫助！

最近在做AnnexinV/PI雙染檢測(cè)凋亡細(xì)胞，用的是凱基生物的AnnexinV/PI試劑盒，細(xì)胞給藥24小時(shí)后，有70%都變圓收縮，還有20-30%都漂了起來(lái)，但是用流式檢測(cè)凋亡的結(jié)果卻只有百分之幾而已，請(qǐng)高手幫我解答下這是為什么��？
PS:本人之前還做了hochest33342和DNA Ladder，結(jié)果都顯示我的藥是有促凋亡作用的。

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流式

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1樓 2010-12-10 09:31:32

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三磷酸腺苷

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richenim(金幣+5): 2010-12-10 11:39:54
dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:59

如果你確定是有凋亡，那么我覺(jué)得應(yīng)該是你制備的問(wèn)題

這是我們實(shí)驗(yàn)室的制備方法

流式細(xì)胞術(shù)雙染測(cè)凋亡的樣品制備

1、將各組細(xì)胞的培養(yǎng)基移入15ml離心管，加終濃度為2%的BSA。
2、用胰酶消化細(xì)胞，吸除胰酶，加原培養(yǎng)基小心吹打成單細(xì)胞。
3、 1500rpm離心5min，棄盡上清。用室溫平衡的PBS 1ml重懸細(xì)胞，小心吹打。

另外，你的細(xì)胞數(shù)也太少了吧，才剛剛好4次方的細(xì)胞，做流式一般要5次方個(gè)細(xì)胞才可信（當(dāng)然有可能是按百分之多少顯示）

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7樓2010-12-10 11:24:51

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dhd997(金幣+2):good 2010-12-10 14:36:38

我們實(shí)驗(yàn)室用凱基的雙染試劑盒就是沒(méi)做出來(lái)，后來(lái)?yè)Q了Trevigen的（和R&D搞貼牌的）就做出來(lái)了~

另外要考慮制備的問(wèn)題，是不是制備的時(shí)候損失了很多細(xì)胞
還有就是有沒(méi)有注意用無(wú)EDTA的胰酶消化細(xì)胞
如果用了EDTA的胰酶，有沒(méi)有PBS洗
還有檢測(cè)的時(shí)候有沒(méi)有注意時(shí)間，以及避光等

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2樓2010-12-10 10:35:38

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引用回帖:

Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-10 10:35:38:
我們實(shí)驗(yàn)室用凱基的雙染試劑盒就是沒(méi)做出來(lái)，后來(lái)?yè)Q了Trevigen的（和R&D搞貼牌的）就做出來(lái)了~

另外要考慮制備的問(wèn)題，是不是制備的時(shí)候損失了很多細(xì)胞
還有就是有沒(méi)有注意用無(wú)EDTA的胰酶消化細(xì)胞
如果用 ...

我送檢的地方都是用的凱基生物的哦，別人都可以做出來(lái)哦！
給藥時(shí)間到了后，我是收集上清，再用胰酶-EDTA消化細(xì)胞，離心1000rpm，5min，再用PBS洗兩次，再將細(xì)胞保存在PBS里面，拿去檢測(cè)。（我從學(xué)校到送檢的地方有兩個(gè)小時(shí)，兩個(gè)小時(shí)中細(xì)胞就保存在PBS里面，然后放在冰盒里，不知道這個(gè)時(shí)間的耽誤有沒(méi)有問(wèn)題哦�。�

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3樓2010-12-10 11:06:36

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上圖吧……結(jié)合圖片給你做分析。而且我做的方法跟你的有點(diǎn)點(diǎn)不一樣

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4樓2010-12-10 11:09:37

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