 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 14263 | 回復(fù): 48 | |||||
| 【獎勵】 本帖被評價23次，作者h(yuǎn)enkally增加金幣 16.8 個 | |||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||||
[資源]
【原創(chuàng)】非變性凝膠電泳原理及應(yīng)用實例 已有1人參與
|
|||||
|
現(xiàn)在大家都是做SDS-PAGE或者雙向電泳比較多，而做非變性電泳的似乎少一些。而我本人接觸非變形電泳較多，一直認(rèn)為它還是很有特點的，能夠有很多獨特應(yīng)用之處的，所以在此結(jié)合我本人經(jīng)歷向大家介紹一下非變性電泳。 非變性電泳，蛋白質(zhì)在電泳過程中是處于非變性的，電泳時蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，非變性電泳在完成電泳后，可以進行蛋白質(zhì)活性測定（如果是酶的話，可以進行酶活檢測）或者檢測同功酶，或含亞基的完整蛋白的分子量，這些特點是SDS-PAGE所不具備的，因為像SDS-PAGE使蛋白變性，亞基解離，無法體現(xiàn)含有亞基的蛋白的真實分子量，也無法進行后續(xù)的蛋白活性檢測了。 非變性電泳和SDS-PAGE相比，其實基本試驗操作是相同的，所以在此我也不一一詳敘了。最大的不同就是樣品中的蛋白是沒有變性的，所以電泳樣品是沒有煮沸的，而且樣品處理液中也是不含去垢劑的。此外的差異還有： 1：在非變性電泳中，體系的PH通常為8.8（濃縮膠和分離膠的PH 8.8）因而大多數(shù)蛋白質(zhì)在這個條件下是帶負(fù)電的。當(dāng)然我想地球上也會有pI大于8.8的蛋白質(zhì)，這樣的條件下，要用低PH系統(tǒng)（這個完全是另一套系統(tǒng)，緩沖體系也不同，我這里就不深入了，有興趣的可以去參考一下汪家政主編的《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》），同時把電泳體系得陰極和陽極倒置就好了，蛋白往膠里跑就行。 2：非變性電泳體系中的離子強度盡量不要太高，離子強度高了會影響蛋白活性；在電泳的時候發(fā)熱也比較厲害。但如果離子強度太低了，可能導(dǎo)致非特異性凝聚。我一般緩沖體系（Tris-Hcl）的離子強度在0.01-0.1mol/L，離子強度是要比SDS-PAGE低的。配膠時Tris-Hcl濃度同樣是要低的。 3：雖然電泳產(chǎn)熱比起western電轉(zhuǎn)是少很多了，但是還是不能忽視啊~所以我一般做非變性電泳還是會用冰浴的，安全起見嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不會用冰浴。 4：因為蛋白質(zhì)未變性，含有亞基的蛋白肯定更大，泳動速度也慢（非變性條件下，蛋白所帶的電荷一般來說也更少），膠的濃度還是小點好，5%-10%就行，我做catalase的非變性電泳膠的濃度是7%（后面我會給一些操作和應(yīng)用實例，和圖片）。SDS-PAGE的條帶區(qū)分開主要是靠分子量大小，而非變性電泳的話，分子量和所帶電荷的多少都是影響因素，這個值得注意。 下面我講兩個應(yīng)用實例，這樣讓大家也能體會到非變性電泳的實際用途。（這兩個例子都是本人做的，謝絕轉(zhuǎn)載哦） 第一個例子：電泳檢測胰蛋白活力， 這個試驗是當(dāng)初我做蛋白純化時候做的一個試驗，挺有意思的，活性電泳的試驗結(jié)果證實了我當(dāng)初從一個公司買的胰蛋白酶粗品沒有酶活，真的是一點都沒有！那個公司的偽劣產(chǎn)品嚴(yán)重干擾了我的試驗進度，最后我還是從肉聯(lián)廠買的胰臟，自己從頭提取。（這個慘痛的經(jīng)歷一直教育我，試驗材料和試劑什么的，一定要從有信譽的公司買�。�。 現(xiàn)在和大家分享一下具體細(xì)節(jié)：試驗用的其實是SDS-PAGE體系，但是樣品上樣前是沒有煮沸的；而在電泳完成后，用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃溫育8小時，就可以用R250染色了。 在分離膠里是加了明膠的，作用在于胰蛋白酶能降解明膠，按上述步驟處理過后，就可以染色，整塊膠被R250染成藍色背景，而被胰蛋白酶降解的區(qū)域不會被染色，仍為透明的（這和通常凝膠的考馬斯亮藍染色結(jié)果正好相反的），可以檢測胰蛋白酶所處的條帶，而且條帶寬度能體現(xiàn)量效關(guān)系。還是給圖比較直觀：（圖1） 對了，給篇參考文獻：《用于植物光系統(tǒng)II蛋白酶檢測的活性染色方法》 好，繼續(xù)。 第二個例子是我做的過氧化氫酶catalase的活性電泳。 這個體系中就沒有SDS了，樣品處理液中我連β-巰基乙醇都沒加。分離膠濃度為7%（pH 8.8），濃縮膠濃度為4%（pH 6.8）。提取的蛋白樣品用2×樣品處理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚藍，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。 過氧化氫酶的染色采用負(fù)染色，用蒸餾水將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠沖洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝膠5 min，在浸泡過程中不斷震蕩染色盤，使之浸泡均勻。浸泡結(jié)束后，倒掉H2O2液，用蒸餾水將凝膠沖洗2次。再用50 mL2%鐵氰化鉀和50 mL2%三氯化鐵混合液進行負(fù)染色10分鐘。直到凝膠在藍紫色背景上出現(xiàn)草綠色酶帶時停止染色。倒掉染色液后，用蒸餾水沖洗凝膠2次。在這里，順便給個染色后的效果圖：（圖2） 我做的植物材料只有一種catalase同工酶。其實在很多植物中catalase同功酶還是比較多的，所以往往有好幾條帶，同工酶還往往是分類，種屬鑒定的輔助手段，同工酶和非變性電泳的用途，大家可以參考以下《電泳》一書（主編何忠效，張樹政），講得比我好多啦。里面膠的配方也講得很詳細(xì)。 講到這里就差不多啦，歡迎大家來此討論。（我打字打了好久啊，原創(chuàng)的�。� |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 電泳、bio-rad 電轉(zhuǎn)化儀及操作 | 專業(yè)電子書 | 分子生物學(xué)實驗 |
» 猜你喜歡
一志愿南航 335分 | 0856 | GPA 4.07 | 有科研經(jīng)歷
已經(jīng)有8人回復(fù)
-
求調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
求化學(xué)調(diào)劑
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
085600，材料與化工321分求調(diào)劑
已經(jīng)有10人回復(fù)
-
0703 化學(xué) 求調(diào)劑，一志愿山東大學(xué) 342 分
已經(jīng)有5人回復(fù)
-
一志愿南開大學(xué)0710生物學(xué)359求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
085600，專業(yè)課化工原理，320分求調(diào)劑
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
材料與化工272求調(diào)劑
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
290求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
327求調(diào)劑
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 短RNA的變性聚丙烯酰胺電泳
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 納米金凝膠電泳
已經(jīng)有26人回復(fù)
- 變性聚丙烯酰胺凝膠 雙帶
已經(jīng)有10人回復(fù)
- SDS-PAGE凝膠電泳跑出來的條帶問題
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 為什么還原變性電泳得到的分子量應(yīng)該大于非還原非變性？？急求！
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 新手請教變性蛋白的電泳，能電泳嗎？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 凝膠電泳時 電泳液的濃度
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 蛋白質(zhì) 熱變性 的原理是什么呢
已經(jīng)有5人回復(fù)
- SDS-PAGE變性凝膠電泳的檢測下限是多少？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- SDS-PAGE變性電泳樣品處理
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 雙向電泳 蛋白純化
已經(jīng)有6人回復(fù)
- SDS-PAGE 凝膠電泳的Marker使用
已經(jīng)有12人回復(fù)
- SDS-PAGE電泳蛋白質(zhì)變性
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 非水毛細(xì)管電泳
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 誰做過淀粉凝膠電泳的啊
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 凝膠電泳 跑好的凝膠圖怎么弄成電子版啊
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 想咨詢下變性電泳和非變性電泳所使用的marker有什么區(qū)別？急急急。。。謝謝~
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 【求助/交流】非變性蛋白電泳用什么marker
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】有意思的rna非變性凝膠電泳-之真相大白
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【求助/交流】SDS-PAGE凝膠電泳
已經(jīng)有33人回復(fù)
- 【求助】SDS-PAGE凝膠電泳
已經(jīng)有13人回復(fù)
|
本帖內(nèi)容被屏蔽 |
5樓2011-01-10 14:13:24
2樓2011-01-08 20:27:44
6樓2011-01-12 15:17:44
7樓2011-01-30 10:33:07
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856 | GPA 4.07 | 有科研經(jīng)歷 +8 | cccchenso 2026-03-29 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 一志愿河北工業(yè)大學(xué)0817化工278分求調(diào)劑 +10 | jhybd 2026-03-23 | 15/750 |
|
|
[考研] 一志愿哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工方向336分 +10 | 辰沐5211314 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 275求調(diào)劑 +15 | Micky11223 2026-03-25 | 20/1000 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +10 | 15188958825 2026-03-25 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 一志愿：西北大學(xué)，英一數(shù)一408-284分求調(diào)劑 +4 | 12.27 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 309求調(diào)劑 +7 | 誰不是少年 2026-03-29 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +5 | 愛羈絆 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 復(fù)試調(diào)劑 +3 | raojunqi0129 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 283求調(diào)劑 +7 | A child 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 0856，材料與化工321分求調(diào)劑 +12 | 大饞小子 2026-03-27 | 13/650 |
|
|
|
[考研] 085602 307分 求調(diào)劑 +7 | 不知道叫什么！ 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 一志愿哈工大總分298分，前三科223分 +5 | dongfang59 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 352分 化工與材料 +5 | 海納百川Ly 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 272求調(diào)劑 +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 08開頭275求調(diào)劑 +4 | 拉誰不重要 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +4 | @taotao 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 一志愿 本科 北科大 化學(xué) 343 +6 | 13831862839 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 325求調(diào)劑 +3 | Aoyijiang 2026-03-23 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +3 | iwinso 2026-03-23 | 3/150 |
|