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【原創(chuàng)】非變性凝膠電泳原理及應(yīng)用實(shí)例 已有1人參與
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現(xiàn)在大家都是做SDS-PAGE或者雙向電泳比較多，而做非變性電泳的似乎少一些。而我本人接觸非變形電泳較多，一直認(rèn)為它還是很有特點(diǎn)的，能夠有很多獨(dú)特應(yīng)用之處的，所以在此結(jié)合我本人經(jīng)歷向大家介紹一下非變性電泳。 非變性電泳，蛋白質(zhì)在電泳過程中是處于非變性的，電泳時蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，非變性電泳在完成電泳后，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)活性測定（如果是酶的話，可以進(jìn)行酶活檢測）或者檢測同功酶，或含亞基的完整蛋白的分子量，這些特點(diǎn)是SDS-PAGE所不具備的，因?yàn)橄馭DS-PAGE使蛋白變性，亞基解離，無法體現(xiàn)含有亞基的蛋白的真實(shí)分子量，也無法進(jìn)行后續(xù)的蛋白活性檢測了。 非變性電泳和SDS-PAGE相比，其實(shí)基本試驗(yàn)操作是相同的，所以在此我也不一一詳敘了。最大的不同就是樣品中的蛋白是沒有變性的，所以電泳樣品是沒有煮沸的，而且樣品處理液中也是不含去垢劑的。此外的差異還有： 1：在非變性電泳中，體系的PH通常為8.8（濃縮膠和分離膠的PH 8.8）因而大多數(shù)蛋白質(zhì)在這個條件下是帶負(fù)電的。當(dāng)然我想地球上也會有pI大于8.8的蛋白質(zhì)，這樣的條件下，要用低PH系統(tǒng)（這個完全是另一套系統(tǒng)，緩沖體系也不同，我這里就不深入了，有興趣的可以去參考一下汪家政主編的《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》），同時把電泳體系得陰極和陽極倒置就好了，蛋白往膠里跑就行。 2：非變性電泳體系中的離子強(qiáng)度盡量不要太高，離子強(qiáng)度高了會影響蛋白活性；在電泳的時候發(fā)熱也比較厲害。但如果離子強(qiáng)度太低了，可能導(dǎo)致非特異性凝聚。我一般緩沖體系（Tris-Hcl）的離子強(qiáng)度在0.01-0.1mol/L，離子強(qiáng)度是要比SDS-PAGE低的。配膠時Tris-Hcl濃度同樣是要低的。 3：雖然電泳產(chǎn)熱比起western電轉(zhuǎn)是少很多了，但是還是不能忽視啊~所以我一般做非變性電泳還是會用冰浴的，安全起見嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不會用冰浴。 4：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)未變性，含有亞基的蛋白肯定更大，泳動速度也慢（非變性條件下，蛋白所帶的電荷一般來說也更少），膠的濃度還是小點(diǎn)好，5%-10%就行，我做catalase的非變性電泳膠的濃度是7%（后面我會給一些操作和應(yīng)用實(shí)例，和圖片）。SDS-PAGE的條帶區(qū)分開主要是靠分子量大小，而非變性電泳的話，分子量和所帶電荷的多少都是影響因素，這個值得注意。 下面我講兩個應(yīng)用實(shí)例，這樣讓大家也能體會到非變性電泳的實(shí)際用途。（這兩個例子都是本人做的，謝絕轉(zhuǎn)載哦） 第一個例子：電泳檢測胰蛋白活力， 這個試驗(yàn)是當(dāng)初我做蛋白純化時候做的一個試驗(yàn)，挺有意思的，活性電泳的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了我當(dāng)初從一個公司買的胰蛋白酶粗品沒有酶活，真的是一點(diǎn)都沒有！那個公司的偽劣產(chǎn)品嚴(yán)重干擾了我的試驗(yàn)進(jìn)度，最后我還是從肉聯(lián)廠買的胰臟，自己從頭提取。（這個慘痛的經(jīng)歷一直教育我，試驗(yàn)材料和試劑什么的，一定要從有信譽(yù)的公司買�。� 現(xiàn)在和大家分享一下具體細(xì)節(jié)：試驗(yàn)用的其實(shí)是SDS-PAGE體系，但是樣品上樣前是沒有煮沸的；而在電泳完成后，用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃溫育8小時，就可以用R250染色了。 在分離膠里是加了明膠的，作用在于胰蛋白酶能降解明膠，按上述步驟處理過后，就可以染色，整塊膠被R250染成藍(lán)色背景，而被胰蛋白酶降解的區(qū)域不會被染色，仍為透明的（這和通常凝膠的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果正好相反的），可以檢測胰蛋白酶所處的條帶，而且條帶寬度能體現(xiàn)量效關(guān)系。還是給圖比較直觀：（圖1） 對了，給篇參考文獻(xiàn)：《用于植物光系統(tǒng)II蛋白酶檢測的活性染色方法》 好，繼續(xù)。 第二個例子是我做的過氧化氫酶catalase的活性電泳。 這個體系中就沒有SDS了，樣品處理液中我連β-巰基乙醇都沒加。分離膠濃度為7%（pH 8.8），濃縮膠濃度為4%（pH 6.8）。提取的蛋白樣品用2×樣品處理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚藍(lán)，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。 過氧化氫酶的染色采用負(fù)染色，用蒸餾水將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠沖洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝膠5 min，在浸泡過程中不斷震蕩染色盤，使之浸泡均勻。浸泡結(jié)束后，倒掉H2O2液，用蒸餾水將凝膠沖洗2次。再用50 mL2%鐵氰化鉀和50 mL2%三氯化鐵混合液進(jìn)行負(fù)染色10分鐘。直到凝膠在藍(lán)紫色背景上出現(xiàn)草綠色酶帶時停止染色。倒掉染色液后，用蒸餾水沖洗凝膠2次。在這里，順便給個染色后的效果圖：（圖2） 我做的植物材料只有一種catalase同工酶。其實(shí)在很多植物中catalase同功酶還是比較多的，所以往往有好幾條帶，同工酶還往往是分類，種屬鑒定的輔助手段，同工酶和非變性電泳的用途，大家可以參考以下《電泳》一書（主編何忠效，張樹政），講得比我好多啦。里面膠的配方也講得很詳細(xì)。 講到這里就差不多啦，歡迎大家來此討論。（我打字打了好久啊，原創(chuàng)的�。� |
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7樓2011-01-30 10:33:07
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