 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 14299 | 回復: 48 | |||||
| 【獎勵】 本帖被評價23次，作者henkally增加金幣 16.8 個 | |||||
| 當前只顯示滿足指定條件的回帖，點擊這里查看本話題的所有回帖 | |||||
[資源]
【原創(chuàng)】非變性凝膠電泳原理及應用實例 已有1人參與
|
|||||
|
現(xiàn)在大家都是做SDS-PAGE或者雙向電泳比較多，而做非變性電泳的似乎少一些。而我本人接觸非變形電泳較多，一直認為它還是很有特點的，能夠有很多獨特應用之處的，所以在此結合我本人經(jīng)歷向大家介紹一下非變性電泳。 非變性電泳，蛋白質在電泳過程中是處于非變性的，電泳時蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，非變性電泳在完成電泳后，可以進行蛋白質活性測定（如果是酶的話，可以進行酶活檢測）或者檢測同功酶，或含亞基的完整蛋白的分子量，這些特點是SDS-PAGE所不具備的，因為像SDS-PAGE使蛋白變性，亞基解離，無法體現(xiàn)含有亞基的蛋白的真實分子量，也無法進行后續(xù)的蛋白活性檢測了。 非變性電泳和SDS-PAGE相比，其實基本試驗操作是相同的，所以在此我也不一一詳敘了。最大的不同就是樣品中的蛋白是沒有變性的，所以電泳樣品是沒有煮沸的，而且樣品處理液中也是不含去垢劑的。此外的差異還有： 1：在非變性電泳中，體系的PH通常為8.8（濃縮膠和分離膠的PH 8.8）因而大多數(shù)蛋白質在這個條件下是帶負電的。當然我想地球上也會有pI大于8.8的蛋白質，這樣的條件下，要用低PH系統(tǒng)（這個完全是另一套系統(tǒng)，緩沖體系也不同，我這里就不深入了，有興趣的可以去參考一下汪家政主編的《蛋白質技術手冊》），同時把電泳體系得陰極和陽極倒置就好了，蛋白往膠里跑就行。 2：非變性電泳體系中的離子強度盡量不要太高，離子強度高了會影響蛋白活性；在電泳的時候發(fā)熱也比較厲害。但如果離子強度太低了，可能導致非特異性凝聚。我一般緩沖體系（Tris-Hcl）的離子強度在0.01-0.1mol/L，離子強度是要比SDS-PAGE低的。配膠時Tris-Hcl濃度同樣是要低的。 3：雖然電泳產(chǎn)熱比起western電轉是少很多了，但是還是不能忽視啊~所以我一般做非變性電泳還是會用冰浴的，安全起見嘛，就怕酶失活。我做SDS-PAGE就不會用冰浴。 4：因為蛋白質未變性，含有亞基的蛋白肯定更大，泳動速度也慢（非變性條件下，蛋白所帶的電荷一般來說也更少），膠的濃度還是小點好，5%-10%就行，我做catalase的非變性電泳膠的濃度是7%（后面我會給一些操作和應用實例，和圖片）。SDS-PAGE的條帶區(qū)分開主要是靠分子量大小，而非變性電泳的話，分子量和所帶電荷的多少都是影響因素，這個值得注意。 下面我講兩個應用實例，這樣讓大家也能體會到非變性電泳的實際用途。（這兩個例子都是本人做的，謝絕轉載哦） 第一個例子：電泳檢測胰蛋白活力， 這個試驗是當初我做蛋白純化時候做的一個試驗，挺有意思的，活性電泳的試驗結果證實了我當初從一個公司買的胰蛋白酶粗品沒有酶活，真的是一點都沒有！那個公司的偽劣產(chǎn)品嚴重干擾了我的試驗進度，最后我還是從肉聯(lián)廠買的胰臟，自己從頭提取。（這個慘痛的經(jīng)歷一直教育我，試驗材料和試劑什么的，一定要從有信譽的公司買�。� 現(xiàn)在和大家分享一下具體細節(jié)：試驗用的其實是SDS-PAGE體系，但是樣品上樣前是沒有煮沸的；而在電泳完成后，用Tris-Hcl緩沖液清洗分離膠，可以充分去除SDS，之后再用清水清洗3次。置于50mmol/L的Tris-HCl (pH 7.5)中37℃溫育8小時，就可以用R250染色了。 在分離膠里是加了明膠的，作用在于胰蛋白酶能降解明膠，按上述步驟處理過后，就可以染色，整塊膠被R250染成藍色背景，而被胰蛋白酶降解的區(qū)域不會被染色，仍為透明的（這和通常凝膠的考馬斯亮藍染色結果正好相反的），可以檢測胰蛋白酶所處的條帶，而且條帶寬度能體現(xiàn)量效關系。還是給圖比較直觀：（圖1） 對了，給篇參考文獻：《用于植物光系統(tǒng)II蛋白酶檢測的活性染色方法》 好，繼續(xù)。 第二個例子是我做的過氧化氫酶catalase的活性電泳。 這個體系中就沒有SDS了，樣品處理液中我連β-巰基乙醇都沒加。分離膠濃度為7%（pH 8.8），濃縮膠濃度為4%（pH 6.8）。提取的蛋白樣品用2×樣品處理液（20%(w/v)甘油以及0.01%(w/v)溴酚藍，0.125mol/LTris-HCl，pH 6.8）溶解。 過氧化氫酶的染色采用負染色，用蒸餾水將電泳后的聚丙烯酰胺凝膠沖洗2次，然后用0.3%的H2O2浸泡凝膠5 min，在浸泡過程中不斷震蕩染色盤，使之浸泡均勻。浸泡結束后，倒掉H2O2液，用蒸餾水將凝膠沖洗2次。再用50 mL2%鐵氰化鉀和50 mL2%三氯化鐵混合液進行負染色10分鐘。直到凝膠在藍紫色背景上出現(xiàn)草綠色酶帶時停止染色。倒掉染色液后，用蒸餾水沖洗凝膠2次。在這里，順便給個染色后的效果圖：（圖2） 我做的植物材料只有一種catalase同工酶。其實在很多植物中catalase同功酶還是比較多的，所以往往有好幾條帶，同工酶還往往是分類，種屬鑒定的輔助手段，同工酶和非變性電泳的用途，大家可以參考以下《電泳》一書（主編何忠效，張樹政），講得比我好多啦。里面膠的配方也講得很詳細。 講到這里就差不多啦，歡迎大家來此討論。（我打字打了好久啊，原創(chuàng)的�。� |
回復此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 電泳、bio-rad 電轉化儀及操作 | 專業(yè)電子書 | 分子生物學實驗 |
» 猜你喜歡
求調劑：一志愿：南京大學 專業(yè)：0705 總分320 ，本科985，四六級已過
已經(jīng)有3人回復
-
環(huán)境工程 085701，267求調劑
已經(jīng)有14人回復
-
308求調劑
已經(jīng)有12人回復
-
求調劑：085600材料與化工，考材科基，總分319
已經(jīng)有21人回復
-
311求調劑
已經(jīng)有8人回復
-
294分080500材料科學與工程求調劑
已經(jīng)有13人回復
-
288求調劑 一志愿哈工大 材料與化工
已經(jīng)有19人回復
-
288資源與環(huán)境專碩求調劑，不限專業(yè)，有學上就行
已經(jīng)有23人回復
-
一志愿085600中科院寧波所276分求調劑
已經(jīng)有17人回復
-
271求調劑
已經(jīng)有11人回復
» 本主題相關商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 短RNA的變性聚丙烯酰胺電泳
已經(jīng)有7人回復
- 納米金凝膠電泳
已經(jīng)有26人回復
- 變性聚丙烯酰胺凝膠 雙帶
已經(jīng)有10人回復
- SDS-PAGE凝膠電泳跑出來的條帶問題
已經(jīng)有20人回復
- 為什么還原變性電泳得到的分子量應該大于非還原非變性？？急求！
已經(jīng)有8人回復
- 新手請教變性蛋白的電泳，能電泳嗎？
已經(jīng)有4人回復
- 凝膠電泳時 電泳液的濃度
已經(jīng)有5人回復
- 蛋白質 熱變性 的原理是什么呢
已經(jīng)有5人回復
- SDS-PAGE變性凝膠電泳的檢測下限是多少？
已經(jīng)有4人回復
- SDS-PAGE變性電泳樣品處理
已經(jīng)有4人回復
- 雙向電泳 蛋白純化
已經(jīng)有6人回復
- SDS-PAGE 凝膠電泳的Marker使用
已經(jīng)有12人回復
- SDS-PAGE電泳蛋白質變性
已經(jīng)有7人回復
- 非水毛細管電泳
已經(jīng)有8人回復
- 誰做過淀粉凝膠電泳的啊
已經(jīng)有4人回復
- 凝膠電泳 跑好的凝膠圖怎么弄成電子版啊
已經(jīng)有7人回復
- 想咨詢下變性電泳和非變性電泳所使用的marker有什么區(qū)別？急急急。。。謝謝~
已經(jīng)有4人回復
- 【求助/交流】非變性蛋白電泳用什么marker
已經(jīng)有5人回復
- 【求助/交流】有意思的rna非變性凝膠電泳-之真相大白
已經(jīng)有10人回復
- 【求助/交流】SDS-PAGE凝膠電泳
已經(jīng)有33人回復
- 【求助】SDS-PAGE凝膠電泳
已經(jīng)有13人回復
henkally
超級版主
|
本帖內容被屏蔽 |
8樓2011-01-30 14:25:44
2樓2011-01-08 20:27:44
henkally
管理員
|
本帖內容被屏蔽 |
5樓2011-01-10 14:13:24
6樓2011-01-12 15:17:44
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 273求調劑 +8 | 李芷新1 2026-03-31 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥298調劑求助 +3 | 元元青青 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 材料科學與工程339求調劑 +3 | hyz0119 2026-03-31 | 3/150 |
|
|
[考研] 0710生物學求調劑！ +5 | 敘述文 2026-03-31 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿南昌大學324求調劑 +6 | hanamiko 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[考研]
 一志愿大連理工大學材料求調劑
+6
|
Gymno 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 福建理工大學材料學院先進合金團隊招收考研調劑學生 +3 | 大華金商都 2026-03-30 | 4/200 |
|
|
|
[有機交流]
甲基亞磺磺酸鈉和甲基磺酸酯反應機理
 10+3
|
kaobao456 2026-03-29 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 085602化工求調劑（331分） +8 | 111@127 2026-03-30 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 332求調劑 +14 | 032500 2026-03-25 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 0703本科鄭州大學求調劑 +7 | nhj_ 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 283求調劑（080500） +14 | A child 2026-03-27 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 343求調劑085601 +3 | 要努力學習x 2026-03-29 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 315分求調劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 265求調劑11408 +3 | 劉小鹿lu 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 272求調劑 +7 | 腳滑的守法公民 2026-03-27 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 348求調劑 +4 | 小懶蟲不懶了 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 321求調劑 +6 | wasdssaa 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 環(huán)境專碩324分求調劑推薦 +5 | 軒小寧—— 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 打過很多競賽，085406控制工程300分，求調劑 +3 | askeladz 2026-03-26 | 3/150 |
|