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[交流]
【求助/交流】釀酒酵母URA3基因敲除的問題
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個(gè)人目前做釀酒酵母過表達(dá)的研究，由于所用質(zhì)粒上的篩選標(biāo)記是URA3(尿嘧啶)營養(yǎng)缺陷，而目標(biāo)菌株是工業(yè)二倍體酵母。所以就根據(jù)文獻(xiàn)利用5-FOA (5-氟乳清酸)通過PCR產(chǎn)物(兩端帶有URA3同源片段，中間為G418篩選標(biāo)記的PCR產(chǎn)物)方法直接轉(zhuǎn)化工業(yè)二倍體酵母， 一開始5-FOA濃度為0.2mg/ml 和2mg/ml 結(jié)果高濃度的平板不長，低濃度5-FOA的平板長滿； 后來用利用YPD加G418篩選，結(jié)果利用SD/SD-URA培養(yǎng)基驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)都能生長； 接下來先測定了二倍體酵母5-FOA的抗性，發(fā)現(xiàn)0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生長， 現(xiàn)在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板來篩選，結(jié)果在1mg/ml 5-FOA G418濃度為120ug/ml 平板上長出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培養(yǎng)基驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)又全部能夠生長，正常情況應(yīng)該是SD不生長，只有補(bǔ)加URA3的SD才能生長。 請問各位蟲友我的問題出在哪里？是不是應(yīng)該將酵母單倍體話后再轉(zhuǎn)化啊？ 比較啰嗦 見諒！ 謝謝幫忙 |
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 URA3敲除 |
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21樓2014-01-10 17:38:42
susizheng
木蟲 (著名寫手)
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★ ★
rainwander(金幣+2):鼓勵(lì)積極參與交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金幣+1): 2011-01-13 10:18:20
rainwander(金幣+2):鼓勵(lì)積極參與交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金幣+1): 2011-01-13 10:18:20
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1、竟然是二倍體，你敲除的時(shí)候可能只是敲除了一半，因此一開始用SD/SD-URA篩選肯定的不容易得到預(yù)期結(jié)果，應(yīng)該一開始用高濃度抗生素篩選，通過抗生素篩選后，再用SD/SD-URA篩選，如果通過抗生素篩選后不能通過SD/SD-URA，說明只敲除了一半，要重新設(shè)計(jì)引物二次敲除。 2、最好不要選取工業(yè)二倍體酵母作為實(shí)驗(yàn)酵母，分子操作上會很麻煩，最好選用試驗(yàn)用的單倍體酵母。 3、釀酒酵母dropout類型現(xiàn)在又很多了，搞到一個(gè)URA3缺陷型的菌株也不難，何必自己敲除，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。 |
2樓2011-01-13 09:41:17
3樓2011-01-13 12:58:16
4樓2011-06-09 17:51:26
5樓2011-10-10 16:58:49
6樓2011-10-11 08:24:58
7樓2011-10-11 08:26:57
8樓2011-12-05 09:43:46
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9樓2012-03-29 21:39:53
10樓2013-03-20 19:46:53
11樓2013-04-02 19:57:05
12樓2013-04-02 19:59:14
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G418是一種氨基糖類抗生素，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合 成，對原梭和真核等細(xì)胞都有毒性，包括細(xì)菌、酵母，植物和哺乳動物細(xì)胞， 是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。Wach等人研究發(fā)現(xiàn)，來自大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn903 的卡那霉素抗性基因與表達(dá)調(diào)控序列來自絲狀真菌Ashbyagossypii(針孢酵母) 的TEF基因相融合，所組成的kanMX元件可以在酵母細(xì)胞中表達(dá)氨基糖苷磷 酸轉(zhuǎn)移酶，將G418轉(zhuǎn)變成無毒形式，從而賦予酵母細(xì)胞以G418抗性 |
13樓2013-04-03 17:09:41
14樓2013-05-23 15:59:45
15樓2013-05-23 16:03:06
16樓2013-05-23 16:32:26
17樓2013-06-03 19:32:34
18樓2013-11-08 10:20:49
susizheng
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19樓2013-11-08 11:17:07
20樓2014-01-10 15:25:58
22樓2014-04-15 16:26:47
23樓2014-09-23 17:09:30
24樓2015-01-07 13:36:59
25樓2015-01-20 10:39:10
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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我就有點(diǎn)不理解了，為什么采用同源臂來敲除S.cerevisiae的ura3基因后，轉(zhuǎn)化子能在含有2mg/ml的FOA的YPD固體平板上生長，而不敲除的對照是不能生長的，說明ura3基因是被破壞的，不然表達(dá)的產(chǎn)物能將FOA轉(zhuǎn)化為有毒的產(chǎn)物，導(dǎo)致不能生長，但轉(zhuǎn)化子卻能在含有FOA上生長（2mg/ml）。但是再轉(zhuǎn)接到Y(jié)NB不加尿嘧啶的平板上，卻又能生長，說明ura3基因又沒有被破壞，要是破壞了，在YNB不含尿嘧啶的平時(shí)上是不能生長的。 2樓認(rèn)為是二倍體的話，若敲除的是其中的一個(gè)ura3基因，那么在含有2mg/ml的FOA平板上照樣也是不能生長的，因?yàn)闆]有被敲除的這個(gè)ura3基因仍會表達(dá)并將FOA分解成有毒的產(chǎn)物，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子不能生長。以二倍體來解釋為什么轉(zhuǎn)化子在YNB不加尿嘧啶的平板上能生長是解釋的通的，但無法解釋為什么仍能在含有FOA的平板上生長。 我做其它的酵母，比如Yarrowia lipolytica也遇到同樣的問題。 |
26樓2015-05-12 09:59:02
27樓2016-03-22 16:41:14
28樓2016-03-22 16:42:59
29樓2018-01-10 17:22:55
30樓2021-06-14 16:06:23
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31樓2022-10-10 09:47:03
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