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lorlarhuan木蟲 (初入文壇)
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[交流]
【求助/交流】Westen blot問題請教 已有8人參與
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| 請問各位前輩，大家在做westen blot時(shí)，跑膠之后轉(zhuǎn)膜，大家都是用什么方法呢？是半干轉(zhuǎn)還是濕轉(zhuǎn)，條件是怎樣確定的呢？轉(zhuǎn)完之后是不是根據(jù)預(yù)染Marker來判斷蛋白是否轉(zhuǎn)過去了呢？我在轉(zhuǎn)膜之后的濾紙上有看到比較清晰的預(yù)染Marker條帶，是否意味著轉(zhuǎn)過了呢？ |
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2樓2011-03-07 11:34:55
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3樓2011-03-07 11:40:03
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4樓2011-03-07 13:27:13
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5樓2011-03-07 13:46:40
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Q1：RNase 是RNA制備的殺手 A1：在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的 RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。 在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時(shí)間。 2. 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。 4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。 5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。 6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。 常用的RNA酶抑制劑 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 Q2：無RNA沉淀 A2: 原因可能如下： 1. 勻漿不完全：勻漿不完全時(shí)，基因組DNA分子仍然很大，溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地釋放到溶液中。 2..沉淀不完全：從小于2×105動/植物細(xì)胞、小于2mg動物組織、小于4mg植物組織或RNA含量低的動/植物組織中提取RNA時(shí)，勻漿體積太大，將造成RNA過分稀釋而不能沉淀下來。當(dāng)從這樣的樣品中提取RNA時(shí)，應(yīng)按比例減少抽提溶液。 Q3：抽提率低 A3：原因可能如下： 1.系統(tǒng)超負(fù)荷：如果過多增加單位體積內(nèi)的樣品量，將引起系統(tǒng)超負(fù)荷。系統(tǒng)超負(fù)荷常導(dǎo)致勻漿不完全、單位體積內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)所占比例增大，使RNA不能有效地釋放到上清中。系統(tǒng)超負(fù)荷還會導(dǎo)致相分離困難，降低RNA沉淀效率。 2.樣品均化或裂解不完全: 勻漿不完全時(shí)，RNA分子易被蛋白質(zhì)和基因組DNA復(fù)合物包裹，不能被有效釋放。 3.終RNA不完全溶解:未溶解的RNA丟失。 4.樣品未及時(shí)處理或細(xì)胞生長過度：樣品分離后短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞內(nèi)RNA酶被激活，細(xì)胞生長過度同樣會激活細(xì)胞內(nèi)RNA酶，若不及時(shí)提取RNA，大部分RNA會被降解。若樣品暫時(shí)不作RNA提取，應(yīng)立即用液氮冷凍完全，置-80℃貯存。 Q4:如何判定分離的總RNA的純度？ A4:需要從兩個(gè)方面著手，缺一不可，特別是新手（1）測定OD260/OD280的比值，測定時(shí)，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀釋。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過低，可能有蛋白質(zhì)污染，過高RNA可能已發(fā)生降解。（2）瓊脂糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強(qiáng)度。變性電泳需要采用MOPS系統(tǒng)，不可以采用DNA 電泳用的TBE或TAE系統(tǒng)。如果OD260/OD280過低（<1.7），通�？梢酝ㄟ^減少組織和細(xì)胞的用量來實(shí)現(xiàn)。 Q5：如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA。 A5：無論用種方式制備的總RNA,要絕對保證不含基因組DNA是不現(xiàn)實(shí)的。如果您希望得到DNA free 的RNA樣品，需要用RNase free的DNase I處理。 Q6：純化的RNA樣品如何保存？ A6：如果希望得到最佳的結(jié)果，純化的RNA需要立即用于下游實(shí)驗(yàn)。RNA可以保存在-80C冰箱，長期保存可以置于液氮中。如果沒有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中，-20度保存。 Q7： RNA降解原因 A7：原因可能如下： 1. 新鮮細(xì)胞：如果沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如 果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞，一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。 2. 新鮮組織：某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。 3. 冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細(xì)胞，如果不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化，所以研磨用具必須預(yù)冷，在碾磨過程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮。樣品研碎后，在液氮剛剛揮發(fā)完時(shí)，將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。 4. 外源RNA酶的污染：，器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。 5. 內(nèi)源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實(shí)驗(yàn)樣品過多；勻漿時(shí)溫度過高。 試驗(yàn)中我使用的總RNA抽提試劑為SunshineBio 總RNA提取試劑是生興生物有限公司提供的，該試劑是一種廣譜型總RNA抽提試劑，可在1小時(shí)內(nèi)從動植物組織、微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等各類樣品中抽提總RNA。該試劑能充分裂解樣品，并有效抑制細(xì)胞內(nèi)核酶活性，保證了所提取總RNA的純度及完整性。 |
6樓2011-03-07 15:05:30
7樓2011-03-07 15:09:04
lorlarhuan
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