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chenting100鐵蟲 (初入文壇)
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cDNA序列3000kb,用ExTaq和LATaq都擴(kuò)gDNA都擴(kuò)不出來,有什么其他的辦法嗎? 聽說有一種Takara的酶,可以分段設(shè)計(jì)引物,把擴(kuò)增每一小段拼接出來,有哪位大俠知道嗎,指導(dǎo)一下,不勝感激啊 |
木蟲 (正式寫手)
小七

木蟲 (正式寫手)
| 請(qǐng)問你是從cDNA里面RT-PCR擴(kuò)增嗎?怎么會(huì)有g(shù)DNA。是的話,那你可以用拼接PCR的方法來做。簡單地說就是你設(shè)計(jì)一對(duì)全長引物,然后設(shè)計(jì)一對(duì)中間引物,大概在1500bp的位置,這一對(duì)中間引物必須是反向互補(bǔ)的,他們分別和全長引物擴(kuò)增得到兩端序列,然后這兩端序列之間退火,用全長引物進(jìn)行拼接PCR,就會(huì)得到你的基因了。特別提到的是酶必須用不加A尾的pfu酶,TAKARA的primer star就可以了,片段GC含量高的話,用相應(yīng)的GC Buffer。好運(yùn)。 |
木蟲 (正式寫手)
鐵蟲 (初入文壇)
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木蟲 (正式寫手)
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