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銀蟲 (初入文壇)

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[交流] 【求助/交流】求解蛋白質(zhì)分離純化的難題

大家好，最近在做蛋白質(zhì)的分離純化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中遇到了一些難題，還請高手指點(diǎn)。
我做真菌產(chǎn)一種酶的分離純化，但是該菌也產(chǎn)很多多糖，不知用什么辦法除去？
對發(fā)酵液鹽析的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，經(jīng)過離心，得到的片狀物浮在液面上，管底部液體澄清，沒有沉淀，請問這是什么原因，怎么解決？Sample Text

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1樓 2011-03-11 18:15:09

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冼亮淀粉酶

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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖交流

發(fā)酵液中加入硫酸銨達(dá)到一定的飽和度之后，理論上是絕對有蛋白質(zhì)沉淀下來的，即使沒有蛋白質(zhì)沉淀，那至少發(fā)酵液里的菌絲碎片和培養(yǎng)基不溶成分也會沉淀。沒有沉淀就說明沉淀跑到液體上層去了。這令我想到一個(gè)現(xiàn)象，雙水相。

硫酸銨是無機(jī)鹽，達(dá)到一定濃度時(shí)會與一些有機(jī)物形成雙水相，上相為有機(jī)相，下相為無機(jī)相。

建議嘗試一下雙水相去除發(fā)酵液雜質(zhì)和有機(jī)雜質(zhì)，之后無機(jī)相繼續(xù)加入硫酸銨鹽析。這樣，碎片、色素、有機(jī)物、雜質(zhì)蛋白質(zhì)都能去除很多。

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9樓2011-03-11 21:49:21

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冼亮淀粉酶

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11樓: Originally posted by 892091690 at 2012-03-14 12:06:00:
我是從米曲霉麩皮曲中提取a-淀粉酶要怎么處理呢？

固體曲加水用果醬機(jī)粉碎，浸泡一小時(shí)，離心即可，這是我現(xiàn)用的方法。

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12樓2012-03-15 01:03:03

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冼亮淀粉酶

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1349019樓: Originally posted by 892091690 at 2012-03-15 10:44:59:
用研缽搗碎行么？

不好，孢子在曲干的時(shí)候會飛得到處都是。

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15樓2012-03-15 23:11:50

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冼亮淀粉酶

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1349426樓: Originally posted by 892091690 at 2012-03-17 12:18:08:
我在提取淀粉酶時(shí)用硫酸銨鹽析沉淀但是用量不知道多少自己隨便加了大約原菌液的5倍后來一些列步驟下來大概稀釋了200倍測OD值時(shí)怎么測都是0~0.100之間的數(shù)值是不是我稀釋的倍數(shù)太大了？如果有3毫升原菌液， ...

這個(gè)，有沒有測過酶活力殘留多少？原菌液的5倍是什么意思？感覺需要整理一下，說得詳細(xì)一點(diǎn)。

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17樓2012-03-17 18:58:27

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冼亮淀粉酶

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1350208樓: Originally posted by 892091690 at 2012-03-22 12:52:05:
我用DNS法測固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)淀粉酶活性時(shí) 參比管中是不加淀粉的粗酶液，測定管是加了淀粉的酶液，測得結(jié)果要么負(fù)值要么0~0.1之間的數(shù)值，可能是什么原因呢？一定要用蒸餾水做參比嗎？我看有些文獻(xiàn)中還設(shè)有對照管沒 ...

國內(nèi)的論文要選擇性地看，有些是作假的。

2.2.6.1.4淀粉酶活力的測定
（1）收集發(fā)酵上清液并作適當(dāng)稀釋。
（2）在2mL EP管中加入350µL含0.25%可溶性淀粉的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在已調(diào)整至需要溫度的水浴鍋中預(yù)熱3min；
（3）取淀粉酶粗酶液50µl加入至緩沖液中；
（4）到達(dá)設(shè)定時(shí)間后，每管加0.8ml DNS試劑終止酶反應(yīng)；
（5）沸水煮5 min后冷水冷卻，瞬時(shí)離心將附著在管壁上的液體甩下；
（6）沸水煮5min的滅活上清液作同樣處理作為對照；
（7）取200µl加到血清板上，測定540nm處光吸收值；
每次實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)，粗酶液活力計(jì)算依照以下方法：
                     G×n×20
1ml發(fā)酵上清液所含有酶活單位= ——————
                     1000
式中G：經(jīng)淀粉酶作用后釋放的葡萄糖量；n：上清液稀釋倍數(shù)；1000：釋放的葡萄糖量µg換算至mg；20：參與反應(yīng)的粗酶液的量50µl換算至1mL

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20樓2012-03-22 14:19:01

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冼亮淀粉酶

專家顧問 (知名作家)

µl為亂碼，微升

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21樓2012-03-22 14:20:37

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冼亮淀粉酶

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1364657樓: Originally posted by 新藝 at 2012-09-09 10:55:30
不知道樓主，用沒用這個(gè)朋友的方法。我以前也遇到過類似樓主的情況，之前是從真菌發(fā)酵菌絲體中提取蛋白的，也是加了硫酸銨后發(fā)現(xiàn)底部沒沉淀，而在上層出現(xiàn)了絮狀物續(xù)集，但是在上層用分液漏斗收集了之后，后續(xù)試驗(yàn) ...

我后來沒有再用雙水相，因?yàn)榉椒ú恢挂环N，有可能很不容易的解決了問題，才發(fā)現(xiàn)可以繞過問題，還有別的方法。

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23樓2012-09-09 15:18:26

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