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xiaoyu1014126

木蟲 (正式寫手)

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[交流] 【求助/交流】轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌復(fù)蘇的轉(zhuǎn)速有影響嗎?

1.通常大腸桿菌DH5a熱轉(zhuǎn)化以后，都要加入少量的不加抗生素的LB在37℃下復(fù)蘇，各位平時(shí)復(fù)蘇的條件是什么呢？多少轉(zhuǎn)多長時(shí)間呢？

2.大腸表達(dá)宿主菌BL21(DE3)熱轉(zhuǎn)化，是42℃，多長時(shí)間呢？常規(guī)是90S,但是pET表達(dá)手冊上是45S，各位平時(shí)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)�？�?fù)蘇的條件是什么呢？多少轉(zhuǎn)多長時(shí)間呢？

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1樓 2011-04-12 19:15:21

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空谷幽風(fēng)

金蟲 (正式寫手)

★ ★ ★
xiaoyu1014126(金幣+1): 2011-04-13 20:27:29
dhd997(金幣+3): good 2011-04-15 09:24:05

引用回帖:

Originally posted by xiaoyu1014126 at 2011-04-12 19:15:21:
1.通常大腸桿菌DH5a熱轉(zhuǎn)化以后，都要加入少量的不加抗生素的LB在37℃下復(fù)蘇，各位平時(shí)復(fù)蘇的條件是什么呢？多少轉(zhuǎn)多長時(shí)間呢？

2.大腸表達(dá)宿主菌BL21(DE3)熱轉(zhuǎn)化，是42℃，多長時(shí)間呢？常規(guī)是90S,但是pET表達(dá)手 ...

1.以轉(zhuǎn)化100ulDH5a感受態(tài)細(xì)胞為例，轉(zhuǎn)化完成后加入800ul的LB培養(yǎng)基37℃ 220r/min震蕩培養(yǎng)1h后就可以涂板。先5000r/min離心5min倒掉大部分上清，剩下的菌體（約80ul）用移液器混勻后均勻涂布在事先預(yù)熱的平板上。
2.熱激時(shí)間的確定與裝感受態(tài)所用的離心管厚度有關(guān)系，所以你會(huì)看到不同的說明書上介紹的熱激時(shí)間不一樣，你可以自己做個(gè)梯度試一下，一般來講30-90s之間都是可以的，當(dāng)然轉(zhuǎn)化率有些許的差異

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4樓2011-04-13 16:51:53

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lxj341401

至尊木蟲 (著名寫手)

★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-04-12 22:09:03
xiaoyu1014126(金幣+1): 2011-04-12 22:27:05

引用回帖:

1、直接放37度水浴中，不轉(zhuǎn)，這時(shí)候細(xì)胞非常脆弱，半小時(shí)候拿到150r/min搖床。
2、我們就用90秒的，復(fù)蘇條件同1。
效果還不錯(cuò)，其他小組也有用不同的方法。

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2樓2011-04-12 19:28:08

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郝釗

金蟲 (小有名氣)

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amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-04-12 22:09:08
xiaoyu1014126(金幣+1): 2011-04-12 22:27:07

復(fù)蘇的時(shí)候不是在1.5離心管里嗎？搖床基本上起不到作用，放在水浴鍋或者培養(yǎng)箱就可以了。關(guān)關(guān)于熱激時(shí)間，這個(gè)更是沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，從45s到120s的都有，這個(gè)影響不是太大，關(guān)鍵還是要看你的感受態(tài)細(xì)胞感受效率和連接液或質(zhì)粒的質(zhì)量。有一個(gè)師妹在忘記熱激的情況下，轉(zhuǎn)化子長了一平板，驗(yàn)證后都是陽性克隆。

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3樓2011-04-12 20:19:07

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logicthief

新蟲 (初入文壇)

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其實(shí)不復(fù)蘇，直接涂板也沒問題，我們實(shí)驗(yàn)室一直這么做。用的是TIANGEN的感受態(tài)。

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6樓2011-04-14 21:11:40

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簡單回復(fù)

6020596255樓

2011-04-14 19:43 回復(fù)

引用回帖:

Originally posted by 郝釗 at 2011-04-12 20:19:07: 復(fù)蘇的時(shí)候不是在1.5離心管里嗎？搖床基本上起不到作用，放在水浴鍋或者培養(yǎng)箱就可以了。關(guān)關(guān)于熱激時(shí)間，這個(gè)更是沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，從45s到120s的都有，這個(gè)影響不是太大，關(guān)鍵還是要看你的感受態(tài)細(xì)胞感受效率和連接 ...

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