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tangchaoxi

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[交流] 【求助/交流】酶連轉(zhuǎn)化

我將載體和片段分別用同樣的兩個酶雙酶切后酶連，轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒酶切驗證，結(jié)果只有一個條帶，大概載體那么大，懷疑是不是載體自連了？如果是的話，我如何避免載體自連，把我的目的片段連上去呢？請各位幫幫忙…

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1樓 2011-03-24 11:13:38

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tangchaoxi(金幣+1): 2011-03-24 15:32:38

載體酶切后加CIP處理

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2樓2011-03-24 11:59:39

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wqj1988926

金蟲 (正式寫手)

對連接產(chǎn)物篩選，一般不是都有一些抗性基因連接后表達(dá)之類的，

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3樓2011-03-24 12:55:58

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tangchaoxi(金幣+2): 2011-03-24 15:30:25

既然是雙酶切，產(chǎn)生的應(yīng)該是不同的粘性末端，怎么會自連，應(yīng)該是其他問題，樓主好好回憶每步

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4樓2011-03-24 13:13:53

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yabxxh

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tangchaoxi(金幣+3): 2011-03-24 15:26:27

這個的話建議酶切時間在四個小時以上，以保證酶切的徹底，另外你的目的片段濃度要足夠的高，最關(guān)鍵的就是載體和目的片段的比例了，我一般是用肉眼觀察，然后決定二者的用量，當(dāng)然還有極端派會去測od，然后算出精確地比例，載體和插入片段的mol比最好是2:7，還有就是連接時間了，快速的話要半個小時，一般的要過夜，做到以上幾點(diǎn)，應(yīng)該會沒有自連了，其實自連還是酶切不夠徹底，因為你是粘性末端，應(yīng)該很好做的，好運(yùn)

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5樓2011-03-24 14:03:39

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Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
這個的話建議酶切時間在四個小時以上，以保證酶切的徹底，另外你的目的片段濃度要足夠的高，最關(guān)鍵的就是載體和目的片段的比例了，我一般是用肉眼觀察，然后決定二者的用量，當(dāng)然還有極端派會去測od，然后算出精確 ...

謝謝！還想問下，酶切不徹底是指我驗證時候酶切不徹底還是我連接之前酶切不徹底？樓上有位蟲友說雙酶切不會自連，那就是我驗證時候酶切有問題？

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6樓2011-03-24 15:30:08

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Originally posted by whyann at 2011-03-24 13:13:53:
既然是雙酶切，產(chǎn)生的應(yīng)該是不同的粘性末端，怎么會自連，應(yīng)該是其他問題，樓主好好回憶每步

謝謝！如果不是自連，那肯定是連上目的片段了，因為載體有抗性啊，沒連上的話是不會轉(zhuǎn)化出來的對嗎？

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7樓2011-03-24 15:31:51

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Originally posted by gongeleven at 2011-03-24 11:59:39:
載體酶切后加CIP處理

CIP是什么東東？

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8樓2011-03-24 15:32:56

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yabxxh

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tangchaoxi(金幣+2): 2011-03-24 16:52:26

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Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 14:03:39:
這個的話建議酶切時間在四個小時以上，以保證酶切的徹底，另外你的目的片段濃度要足夠的高，最關(guān)鍵的就是載體和目的片段的比例了，我一般是用肉眼觀察，然后決定二者的用量，當(dāng)然還有極端派會去測od，然后算出精確 ...

我的意思是你連接之前的酶切要徹底，另外，做一個對照，轉(zhuǎn)個質(zhì)粒，看看感受態(tài)有沒有問題。

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9樓2011-03-24 15:44:27

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Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 15:44:27:
我的意思是你連接之前的酶切要徹底，另外，做一個對照，轉(zhuǎn)個質(zhì)粒，看看感受態(tài)有沒有問題。

連接之前酶切怎么驗證呢？片段很小很小，電泳無法檢測。

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10樓2011-03-24 16:54:29

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tangchaoxi(金幣+1): 2011-03-25 08:47:30

感覺像沒有切開吧，呵呵~

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11樓2011-03-24 16:55:38

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yabxxh

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tangchaoxi(金幣+1): 2011-03-25 08:48:14

無法驗證，只能按照內(nèi)切酶的說明書酶切相應(yīng)時間以上，以前用國內(nèi)的酶我一般過夜，現(xiàn)在用Fermentas的快速內(nèi)切酶，一個小時就夠了

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12樓2011-03-24 16:58:59

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Originally posted by rioarsenal at 2011-03-24 16:55:38:
感覺像沒有切開吧，呵呵~

是連接前沒有切開嗎？

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13樓2011-03-25 08:48:04

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Originally posted by yabxxh at 2011-03-24 16:58:59:
無法驗證，只能按照內(nèi)切酶的說明書酶切相應(yīng)時間以上，以前用國內(nèi)的酶我一般過夜，現(xiàn)在用Fermentas的快速內(nèi)切酶，一個小時就夠了

我用的是NEB的酶，酶切4個小時。

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14樓2011-03-25 08:49:53

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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 08:48:04:
是連接前沒有切開嗎？

是啊，建議你酶切后，做個電泳看看是否切開

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15樓2011-03-25 10:27:14

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Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 10:27:14:
是啊，建議你酶切后，做個電泳看看是否切開

沒有辦法檢測的，切下的片段很小

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16樓2011-03-25 11:38:18

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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 11:38:18:
沒有辦法檢測的，切下的片段很小

基因片段是檢測不了，一般酶切也沒啥問題。載體是可以檢測的，酶切后，載體超螺旋和開環(huán)的帶都應(yīng)該消失，只有線狀的帶；酶切之前，應(yīng)該是三條帶。

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17樓2011-03-25 17:21:39

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Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是檢測不了，一般酶切也沒啥問題。載體是可以檢測的，酶切后，載體超螺旋和開環(huán)的帶都應(yīng)該消失，只有線狀的帶；酶切之前，應(yīng)該是三條帶。

非常感謝，這倒提醒我了。我是跟別人拿的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌，再提出來以備后用，當(dāng)時提出來檢測結(jié)果是一條帶，別人的是三條帶。因為這個載體有抗性，所以當(dāng)時覺得轉(zhuǎn)化子肯定沒問題。質(zhì)粒非得有三條帶嗎？

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18樓2011-03-25 21:48:25

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Originally posted by rioarsenal at 2011-03-25 17:21:39:
基因片段是檢測不了，一般酶切也沒啥問題。載體是可以檢測的，酶切后，載體超螺旋和開環(huán)的帶都應(yīng)該消失，只有線狀的帶；酶切之前，應(yīng)該是三條帶。

怎么沒消息了呢

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19樓2011-03-28 09:18:25

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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-25 21:48:25:
非常感謝，這倒提醒我了。我是跟別人拿的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌，再提出來以備后用，當(dāng)時提出來檢測結(jié)果是一條帶，別人的是三條帶。因為這個載體有抗性，所以當(dāng)時覺得轉(zhuǎn)化子肯定沒問題。質(zhì)粒非得有三條帶嗎？

質(zhì)粒也不都是三條帶，但是酶切后肯定質(zhì)粒，應(yīng)該與原來的質(zhì)粒電泳圖不一樣

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20樓2011-03-28 09:55:19

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Originally posted by tangchaoxi at 2011-03-28 09:18:25:
怎么沒消息了呢

你電泳做了么？

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21樓2011-03-28 09:55:49

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連接片段那么小，載體又那么大，酶切應(yīng)該看不出來的。不如直接測序吧，最可靠。

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22樓2011-03-28 10:04:52

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Originally posted by rioarsenal at 2011-03-28 09:55:49:
你電泳做了么？

做了，現(xiàn)在確定連接之前切開了，為什么對轉(zhuǎn)化子酶切驗證不出來呢

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23樓2011-03-28 13:30:07

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zmw_520

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24樓2011-03-28 19:54:54

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Originally posted by zmw_520 at 2011-03-28 19:54:54:
是堿性磷酸酶，去磷酸化用的，但是你是雙酶切，應(yīng)該用不著~~~

哦，同樣感謝！

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25樓2011-03-29 09:19:36

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