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[交流]
【求助】小麥籽粒中蔗糖-淀粉轉化過程中關鍵酶活性測定
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| 請問有沒有哪位做過小麥籽粒中蔗糖-淀粉轉化過程中關鍵酶（SS、SPS、ADPG-PPase、UDPG-PPase、SSS、GBSS）活性的測定。 求方法。 |
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8樓2011-04-13 02:11:28
★
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
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大田實驗在開花期掛牌標記生長一致且同日開花的麥穗，花后每隔5天取樣，每次15穗，取其劍葉和籽粒，經(jīng)液氮速凍后，置于-40℃冰箱保存，用于腺苷二磷酸葡糖糖焦磷酸化酶（AGPP）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、束縛態(tài)淀粉合成酶（GBSS）的測定。另取15穗，分離籽粒置于烘箱中105℃殺青30min，然后80℃烘干稱重，籽粒經(jīng)微型高速萬能粉碎機粉碎后，用于蔗糖、可溶性總糖、淀粉及其組分含量的測定。 蔗糖含量的測定采用間苯二酚法，可溶性總糖含量的測定采用蒽酮比色法。 取20個籽粒，加4ml提取液（含100mmol/L Tricine—NaOH（PH=7.5），8mmol/LMgCl2，2mmol/LEDTA，12.5%（V/V）甘油，1%（W/V）PVP—40，50mmol/L2—巰基乙醇），磨成勻漿，在10000×g離心30min，然后收集上清液置于冰浴，作為粗酶液備用。沉淀用1ml提取液洗滌兩次，然后懸浮于2ml的提取介質中，用與GBSS活性測定。 AGPP活性測定：取20µl酶粗提取加入110µl反應液中（反應液最終濃度是100mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、1.2mmol/LADPG，3mmol/LPPi，5mmol/L MgCl2，4mmol/LDTT），30℃反應20min后，沸水中終止反應30s，10000×g，10min，取上清液100µl加5.2µl比色液（5.76mmol/LNADP，0.08unitP—glucomutase（磷酸葡萄糖變位酶），0.07unitG6P—脫氫酶）。30℃反應10min后，測定340nmOD值。根據(jù)OD值的增加量計算ADPG焦磷酸化酶的活力，單位為nmol/1000seeds min，以20µl煮沸的粗酶液作為對照。 SSS、GBSS活性的測定：取20µl酶粗提取液加入36µl反應液Ⅰ（反應液最終濃度為50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、1.6mmol/LADPG、0.7mg支鏈淀粉、15mmol/LDTT），30℃反應20min后，沸水中終止反應30s，冰浴中冷卻；加20µl反應液Ⅱ（含50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、4mmol/LPEP、200mmol/LKCl、10mmol/LMgCl2、1.2unit丙酮酸激酶），30℃反應20min后，沸水中終止反應30s，10000×g離心10min。取上清液60µl與43µl反應液Ⅲ（50mmol/LHEPES—NaOH（PH=7.4）、10mmol/L葡萄糖、20mM MgCl2、2mmol/LNADP、1.4unit己糖激酶、0.35unit G6P—脫氫酶），30℃反應10min后，測定340nmOD值的變化，單位為nmol/1000seeds min，以20µl煮沸的粗酶液作為對照。 希望對你有所幫助，呵呵 |
11樓2011-12-04 16:22:09
2樓2011-04-07 14:47:57
3樓2011-04-07 16:08:15
4樓2011-04-07 16:34:58
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16樓2013-06-03 10:40:51
17樓2013-07-04 17:56:49
18樓2013-11-12 20:06:23
20樓2015-02-09 21:29:24
簡單回復
baqs123419樓
2013-11-15 22:51
回復
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