xtcao668

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[交流] 【求助/交流】pYES2 載體構(gòu)建表達方向的問題

最近在做將質(zhì)粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后將G418 基因擴增后連接進行質(zhì)粒改造，問題是在設(shè)計引物時擴增G418基因上游引物帶有NdeI酶切位點，下游帶有NheI 酶切位點，如圖所示以GAL1啟動子為1，酶切位點NdeI(3700,如圖在NheI的右側(cè))，NheI (3840)，請問各位蟲友這樣連接的話是不是外源的G418基因連接方向是反向的，我是否需要重新合成引物調(diào)換酶切位點？謝謝幫忙！

[ Last edited by xtcao668 on 2011-4-13 at 09:02 ]

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1樓 2011-04-12 23:44:19

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西瓜

榮譽版主 (知名作家)

xtcao668(金幣+1): 謝謝交流 2011-04-26 15:21:45

引用回帖:

Originally posted by xtcao668 at 2011-04-12 23:44:19:
最近在做將質(zhì)粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后將G418 基因擴增后連接進行質(zhì)粒改造，問題是在設(shè)計引物時擴增G418基因上游引物帶有NdeI酶切位點，下游帶有NheI 酶切位點，如圖所示以GAL1啟動子為1，酶切位 ...

NdeI(3700)在圖上沒看到呢

還是我眼濁了？

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2樓2011-04-13 00:08:11

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xtcao668

至尊木蟲 (著名寫手)

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在NheI的右側(cè)，謝謝！圖上忘了標注！

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3樓2011-04-13 09:03:52

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susizheng

木蟲 (著名寫手)

★ ★ ★
xtcao668(金幣+2): 謝謝幫忙！ 2011-04-13 09:45:45
西瓜(金幣+3): good 2011-04-13 10:33:35
xtcao668(金幣+1): 謝謝！ 2011-04-26 15:22:13

引用回帖:

Originally posted by xtcao668 at 2011-04-13 09:03:52:
在NheI的右側(cè)，謝謝！圖上忘了標注！

你擴增G418基因的時候，是應(yīng)該連帶G418基因前面的啟動子一起擴增的，是整個表達元件的擴增（僅擴增基因沒辦法表達哦），竟然是整個表達元件插入到載體，作為一個整體的表達單元在載體上正插入和反插入都能表達的。
PS：你也看到了，質(zhì)粒圖譜箭頭都有逆時針方向和順時針方向同時存在的。

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4樓2011-04-13 09:35:55

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haiyanli111

新蟲 (初入文壇)

★
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引用回帖:

4樓: Originally posted by susizheng at 2011-04-13 09:35:55
你擴增G418基因的時候，是應(yīng)該連帶G418基因前面的啟動子一起擴增的，是整個表達元件的擴增（僅擴增基因沒辦法表達哦），竟然是整個表達元件插入到載體，作為一個整體的表達單元在載體上正插入和反插入都能表達的 ...

你好！我也遇到了前面那位的問題，你說的表達元件是什么意思，我構(gòu)建的時候直接在起始密碼子和終止密碼子前后加的酶切位點，這樣是一個基因吧！謝謝指教！

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5樓2013-06-17 09:30:00

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cxtcjf

木蟲 (正式寫手)

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5樓: Originally posted by haiyanli111 at 2013-06-17 09:30:00
你好！我也遇到了前面那位的問題，你說的表達元件是什么意思，我構(gòu)建的時候直接在起始密碼子和終止密碼子前后加的酶切位點，這樣是一個基因吧！謝謝指教！...

基因的啟動子、ORF和終止子啊

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6樓2013-06-17 21:50:34

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jiaoxiayoulu

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太復雜了，直接把兩個LOXP一起弄進去就得了

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7樓2014-06-23 10:20:33

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jiaoxiayoulu

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請問樓主構(gòu)建成功了嗎？我現(xiàn)在也在這樣構(gòu)建！但沒有成功，不知道樓主能否饋贈該質(zhì)粒呢！謝謝

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8樓2014-08-12 11:14:19

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wu-ke-da

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8樓: Originally posted by jiaoxiayoulu at 2014-08-12 11:14:19
請問樓主構(gòu)建成功了嗎？我現(xiàn)在也在這樣構(gòu)建！但沒有成功，不知道樓主能否饋贈該質(zhì)粒呢！謝謝

親，請問您有pYES2質(zhì)粒嗎？能否贈送一些？

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9樓2015-05-18 15:13:50

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