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xtcao668

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[交流] 【求助/交流】pYES2 載體構(gòu)建表達(dá)方向的問(wèn)題

最近在做將質(zhì)粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后將G418 基因擴(kuò)增后連接進(jìn)行質(zhì)粒改造，問(wèn)題是在設(shè)計(jì)引物時(shí)擴(kuò)增G418基因上游引物帶有NdeI酶切位點(diǎn)，下游帶有NheI 酶切位點(diǎn)，如圖所示以GAL1啟動(dòng)子為1，酶切位點(diǎn)NdeI(3700,如圖在NheI的右側(cè))，NheI (3840)，請(qǐng)問(wèn)各位蟲(chóng)友這樣連接的話是不是外源的G418基因連接方向是反向的，我是否需要重新合成引物調(diào)換酶切位點(diǎn)？謝謝幫忙！

[ Last edited by xtcao668 on 2011-4-13 at 09:02 ]

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1樓 2011-04-12 23:44:19

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xtcao668

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在NheI的右側(cè)，謝謝！圖上忘了標(biāo)注！

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3樓2011-04-13 09:03:52

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西瓜

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xtcao668(金幣+1): 謝謝交流 2011-04-26 15:21:45

引用回帖:

Originally posted by xtcao668 at 2011-04-12 23:44:19:
最近在做將質(zhì)粒pYES2 ura3 基因用Nde I 和Nhe I酶切后將G418 基因擴(kuò)增后連接進(jìn)行質(zhì)粒改造，問(wèn)題是在設(shè)計(jì)引物時(shí)擴(kuò)增G418基因上游引物帶有NdeI酶切位點(diǎn)，下游帶有NheI 酶切位點(diǎn)，如圖所示以GAL1啟動(dòng)子為1，酶切位 ...

NdeI(3700)在圖上沒(méi)看到呢

還是我眼濁了？

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2樓2011-04-13 00:08:11

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susizheng

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★ ★ ★
xtcao668(金幣+2): 謝謝幫忙！ 2011-04-13 09:45:45
西瓜(金幣+3): good 2011-04-13 10:33:35
xtcao668(金幣+1): 謝謝！ 2011-04-26 15:22:13

引用回帖:

Originally posted by xtcao668 at 2011-04-13 09:03:52:
在NheI的右側(cè)，謝謝！圖上忘了標(biāo)注！

你擴(kuò)增G418基因的時(shí)候，是應(yīng)該連帶G418基因前面的啟動(dòng)子一起擴(kuò)增的，是整個(gè)表達(dá)元件的擴(kuò)增（僅擴(kuò)增基因沒(méi)辦法表達(dá)哦），竟然是整個(gè)表達(dá)元件插入到載體，作為一個(gè)整體的表達(dá)單元在載體上正插入和反插入都能表達(dá)的。
PS：你也看到了，質(zhì)粒圖譜箭頭都有逆時(shí)針?lè)较蚝晚槙r(shí)針?lè)较蛲瑫r(shí)存在的。

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4樓2011-04-13 09:35:55

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haiyanli111

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

引用回帖:

4樓: Originally posted by susizheng at 2011-04-13 09:35:55
你擴(kuò)增G418基因的時(shí)候，是應(yīng)該連帶G418基因前面的啟動(dòng)子一起擴(kuò)增的，是整個(gè)表達(dá)元件的擴(kuò)增（僅擴(kuò)增基因沒(méi)辦法表達(dá)哦），竟然是整個(gè)表達(dá)元件插入到載體，作為一個(gè)整體的表達(dá)單元在載體上正插入和反插入都能表達(dá)的 ...

你好！我也遇到了前面那位的問(wèn)題，你說(shuō)的表達(dá)元件是什么意思，我構(gòu)建的時(shí)候直接在起始密碼子和終止密碼子前后加的酶切位點(diǎn)，這樣是一個(gè)基因吧！謝謝指教！

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5樓2013-06-17 09:30:00

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