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[交流] 【求助/交流】關(guān)于提取基因組DNA過(guò)程中遇到的難題

最近在提取基因組DNA，遇到一個(gè)難題。
方法如下：
1．將待測(cè)菌體和模式菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取50ml培養(yǎng)液，4℃ 14,000rpm離心5min。
2．加5ml 0.85% NaCl溶液，充分懸浮后4℃ 14,000rpm離心5min，棄上清。
3．加3ml STE 溶液，充分懸浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混勻后37℃溫浴60 min。
4．加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃溫浴2h。
5．加入5MNaCl（850μl），使終濃度為1M，充分混勻。
6．加等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），充分混勻，4℃14,000rpm，離心5min，吸上層水相于另一干凈離心管中。
7．再加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），混勻后4℃ 6,000rpm，離心10min，吸上層水相于另一干凈離心管中。
8．加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃溫浴60min。
9．重復(fù)步驟6和步驟7，直至中間無(wú)蛋白層。
10. 加等倍體積的預(yù)冷異丙醇，用玻璃棒纏出絲狀DNA。
11．用70%的乙醇進(jìn)行脫鹽處理后自然風(fēng)干。

現(xiàn)提取同一屬的四株菌，結(jié)果其它3株很容易就提取出來(lái)了，而且DNA量還比較大，但是有一株無(wú)論如何也不能在最后卷出DNA。

該菌培養(yǎng)3或4d，除蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白層很厚，培養(yǎng)2d的話除蛋白時(shí)蛋白層比較薄。這是什么原因？為什么這個(gè)菌這么難搞定？
同時(shí)鏡檢觀察4d 和 2d 的菌體都沒(méi)有自溶現(xiàn)象。

該菌為革蘭氏陰性菌，換用CTAB法提取，最后仍是無(wú)法卷出DNA絲（離心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁應(yīng)該沒(méi)什么問(wèn)題，可就是無(wú)法得到那種卷出的DNA絲。

[ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ]

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1樓 2011-04-13 11:30:54

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802311820(金幣+1):謝謝參與

我們直接買(mǎi)的天根提基因組DNA的試劑盒
也不貴提的出來(lái)非常好
相當(dāng)初我剛?cè)?shí)驗(yàn)室就給師姐提
之前都沒(méi)見(jiàn)過(guò)直接按試劑盒操作步驟來(lái)的提的DNA濃度純度都非常好

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2樓2011-04-13 11:45:28

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Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 11:45:28:
我們直接買(mǎi)的天根提基因組DNA的試劑盒
也不貴提的出來(lái)非常好
相當(dāng)初我剛?cè)?shí)驗(yàn)室就給師姐提
之前都沒(méi)見(jiàn)過(guò)直接按試劑盒操作步驟來(lái)的提的DNA濃度純度都非常好

用試劑盒提出來(lái)的DNA量多嗎，我需要量很大，要0.5mg吧，這個(gè)量能達(dá)到嗎？

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3樓2011-04-13 11:54:34

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dhd997(金幣+3): 熱心鼓勵(lì) 2011-04-13 13:28:58

你可以多用幾個(gè)柱子
洗脫的時(shí)候洗脫液洗完一個(gè)柱子如果DNA濃度達(dá)不到可以吸起來(lái)再洗一個(gè)柱子
一開(kāi)始收集菌液也可以多離心幾次收集，也可以多準(zhǔn)備幾管菌液
這個(gè)試劑盒效率還蠻高應(yīng)該可以的

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4樓2011-04-13 12:00:48

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Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 11:30:54:
最近在提取基因組DNA，遇到一個(gè)難題。
方法如下：
1．將待測(cè)菌體和模式菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取50ml培養(yǎng)液，4℃ 14,000rpm離心5min。
2．加5ml 0.85% NaCl溶液，充分懸浮后4℃ 14,000rpm離心5min，棄上清。 ...

原因可能有2個(gè)，1個(gè)是你這個(gè)菌株是革蘭氏陽(yáng)性的，2可能是蛋白干擾
建議將樣品反復(fù)凍溶幾次或者用液氮研磨

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5樓2011-04-13 12:13:54

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Originally posted by yeyun0213 at 2011-04-13 12:00:48:
你可以多用幾個(gè)柱子
洗脫的時(shí)候洗脫液洗完一個(gè)柱子如果DNA濃度達(dá)不到可以吸起來(lái)再洗一個(gè)柱子
一開(kāi)始收集菌液也可以多離心幾次收集，也可以多準(zhǔn)備幾管菌液
這個(gè)試劑盒效率還蠻高應(yīng)該可以的

很久以前用過(guò)進(jìn)口的試劑盒，純度倒是不錯(cuò)，就是量太少了，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠用，后來(lái)就干脆放棄試劑盒，直接手工提取，每次提取量都很大，純度也不錯(cuò)。就這樣一直到現(xiàn)在，但沒(méi)想到有的菌會(huì)有這種特殊情況，現(xiàn)在就想找到原因，看怎么改進(jìn)能夠把這株菌提出來(lái)。
謝謝您提供的資料。

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6樓2011-04-13 12:14:38

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Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:13:54:
原因可能有2個(gè)，1個(gè)是你這個(gè)菌株是革蘭氏陽(yáng)性的，2可能是蛋白干擾
建議將樣品反復(fù)凍溶幾次或者用液氮研磨

這個(gè)是革蘭氏陰性的，和另外提出來(lái)的3株菌是同一菌屬的。
這個(gè)蛋白干擾，是說(shuō)除蛋白時(shí)連DNA也一起除去了嗎？蛋白層薄厚有什么影響嗎？
蛋白層厚是說(shuō)明蛋白還沒(méi)有降解嗎？

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7樓2011-04-13 12:18:34

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Originally posted by 802311820 at 2011-04-13 12:18:34:
這個(gè)是革蘭氏陰性的，和另外提出來(lái)的3株菌是同一菌屬的。
這個(gè)蛋白干擾，是說(shuō)除蛋白時(shí)連DNA也一起除去了嗎？蛋白層薄厚有什么影響嗎？
蛋白層厚是說(shuō)明蛋白還沒(méi)有降解嗎？

主要是分泌的EPS有影響

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8樓2011-04-13 12:29:43

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Originally posted by wolfebst at 2011-04-13 12:29:43:
主要是分泌的EPS有影響

EPS是什么？

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9樓2011-04-13 12:52:32

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10樓2011-04-13 13:41:35

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