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[交流]
【求助/交流】關(guān)于提取基因組DNA過程中遇到的難題
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最近在提取基因組DNA，遇到一個難題。 方法如下： 1． 將待測菌體和模式菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取50ml培養(yǎng)液，4℃ 14,000rpm離心5min。 2． 加5ml 0.85% NaCl溶液，充分懸浮后4℃ 14,000rpm離心5min，棄上清。 3． 加3ml STE 溶液，充分懸浮后加30μl（100mg/ml）溶菌酶，混勻后37℃溫浴60 min。 4． 加330μl 10%SDS，加40μl蛋白酶K（20mg/ml），37℃溫浴2h。 5． 加入5MNaCl（850μl），使終濃度為1M，充分混勻。 6． 加等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），充分混勻，4℃14,000rpm，離心5min，吸上層水相于另一干凈離心管中。 7． 再加等體積的氯仿：異戊醇（24：1），混勻后4℃ 6,000rpm，離心10min，吸上層水相于另一干凈離心管中。 8． 加入5μl RNase(12.5mg/ml)，37℃溫浴60min。 9． 重復(fù)步驟6和步驟7，直至中間無蛋白層。 10. 加等倍體積的預(yù)冷異丙醇，用玻璃棒纏出絲狀DNA。 11．用70%的乙醇進行脫鹽處理后自然風干。 現(xiàn)提取同一屬的四株菌，結(jié)果其它3株很容易就提取出來了，而且DNA量還比較大，但是有一株無論如何也不能在最后卷出DNA。 該菌培養(yǎng)3或4d，除蛋白時發(fā)現(xiàn)蛋白層很厚，培養(yǎng)2d的話除蛋白時蛋白層比較薄。這是什么原因？為什么這個菌這么難搞定？ 同時鏡檢觀察4d 和 2d 的菌體都沒有自溶現(xiàn)象。 該菌為革蘭氏陰性菌，換用CTAB法提取，最后仍是無法卷出DNA絲（離心有沉淀）。初始菌量很大，加了很多溶菌酶和蛋白酶K，破壁應(yīng)該沒什么問題，可就是無法得到那種卷出的DNA絲。 [ Last edited by 802311820 on 2011-4-14 at 20:36 ] |
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