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化工人2010木蟲 (小有名氣)
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[求助]
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求助
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SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的電壓、電流與跑電泳時(shí)間怎么確定啊， 恒壓 還是恒流 濃縮膠和分離膠濃度由什么決定啊 我做的是羊毛的溶解，附件是我的羊毛蛋白的電泳圖 條件：分離膠15%, 濃縮膠5%, 垂直平板電泳, 加樣量為7μL。電極緩沖液為Tris-HCl( pH 8.3)系統(tǒng)。電流40mA，濃縮膠電壓100v，分離膠電壓150v。 條帶很模糊，這是什么原因啊 。是不是羊毛的溶解 分子量較雜 還是因?yàn)榈鞍兹芤翰患兊脑蚰兀?br /> 我不想測很精確 只想知道一個大概的范圍 你看我們的譜圖 是不是只要染上色的地方 就能說是有那個范圍的蛋白嗎 就是4.1KD-66KD的蛋白都有嗎 我們現(xiàn)在又買了一個14.4KD-96KD的marker 不過還是那樣 很模糊，整個柱都有顏色 郁悶！ 哪位做過凝膠電泳的蟲友給指點(diǎn)一下 啊 不勝感激！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare(金幣+5, EPI+1): 2011-04-21 08:35:54
silicare(金幣+5, EPI+1): 2011-04-21 08:35:54
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ladder跑得好，說明電泳膠、電泳液、電壓電流沒問題，給我的感覺是 1、拖帶 樣品中整個泳道都看不出明顯的單條蛋白質(zhì)帶，說明有可能樣品的制備有問題。 2、形狀 樣品中即使是拖帶，從加樣孔到后面，形狀也不是呈倒梯形，而是中間有突出，所以我猜測可能有蛋白質(zhì)樣品在內(nèi)，而且不止是一種蛋白質(zhì)。 3、上樣量 考馬斯亮藍(lán)染色還是比較敏感的，這么藍(lán)，說明可能蛋白質(zhì)很多，建議做一個上樣量梯度，可以將樣品進(jìn)行2倍為一個梯度，做幾個稀釋梯度再上樣跑，看看會不會有蛋白質(zhì)條帶。 4、樣品處理 我跑SDS-PAGE從來不煮，所以我覺得不煮也沒關(guān)系，反正已經(jīng)有SDS了，但是穩(wěn)妥起見，還是煮了算了，起碼減少一個不確定因素。 5、浪費(fèi) 一塊膠10個上樣孔，你有五個沒用上，下次設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)一些，總會有些有趣的東西可以一起跑的。 |
3樓2011-04-20 22:22:55
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