 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 查看: 3119 | 回復(fù): 13 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 2 個 MolEPI ，點擊這里進(jìn)行查看 | ||||
niuniu2010銅蟲 (初入文壇)
|
[求助]
感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化？
|
|||
|
這是我制備感受態(tài)及轉(zhuǎn)化的流程，近期轉(zhuǎn)化一直不成功，請大家給予指導(dǎo)。轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒是長期存于-40℃的，不知道影響大不？ （一）DH5a菌感受態(tài)的制備： 1、從LB平板上挑取DH5a單菌落,接種于3LB液體培養(yǎng)基中 37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右直至對數(shù)生長后期培養(yǎng)基中。 2、將菌懸液以1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再將菌懸液以1:100的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生長對數(shù)期），約2-3h 3、將菌液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的50ml無菌離心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 4、每只離心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌體重懸，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 5、每只離心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸后分裝到無菌的1.5ml離心管中(每管100µl)； 6、置-40℃冰箱長期保存； （二）DH5a大腸桿菌的熱擊轉(zhuǎn)化： ⑴ 分別在1管100µl感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒1-2µl和無菌水1-2µl（陰性對照），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)溶物，冰浴30min； ⑵ 將離心管放至42℃的循環(huán)水浴中90s； ⑶ 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻至室溫； ⑷ 每管加800µl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中45min； ⑸ 取l轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻璃棒將菌液涂滿整個平板表面； ⑹ 將平板置于超凈臺中直至平板表面菌液被吸收； ⑺ 封好平皿，倒置于37℃培養(yǎng)，12-16h。 [ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ] |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有151人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有3人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 感受態(tài)細(xì)胞里到底有沒有質(zhì)粒？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備中遇到的問題
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 急求釀酒酵母的電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備方法和轉(zhuǎn)化方法
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 乳酸菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助】感受態(tài)細(xì)胞制備
已經(jīng)有10人回復(fù)
- 【分享】農(nóng)桿菌感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化方法
已經(jīng)有19人回復(fù)
- 【專題】------------------感受態(tài)、轉(zhuǎn)化專題------------------
已經(jīng)有24人回復(fù)
- 【求助/交流】請問本身有抗性的菌株制備感受態(tài)全程需要加抗性嗎
已經(jīng)有9人回復(fù)
elvias
鐵桿木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 18
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 5850.5
- 紅花: 7
- 帖子: 389
- 在線: 91.5小時
- 蟲號: 302177
- 注冊: 2006-12-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 腫瘤免疫
3樓2011-04-22 13:12:01
beibei9535
榮譽(yù)版主 (職業(yè)作家)
暈暈小版主~ 姑娘你好！
- MolEPI: 7
- 應(yīng)助: 15 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.093
- 金幣: 4037.5
- 散金: 5916
- 紅花: 76
- 沙發(fā): 19
- 帖子: 3211
- 在線: 1083.4小時
- 蟲號: 769521
- 注冊: 2009-05-13
- 專業(yè): 微生物學(xué)
- 管轄: 海外院所點評
7樓2011-04-22 16:35:57
lxj341401
至尊木蟲 (著名寫手)
- MolEPI: 58
- 應(yīng)助: 388 (碩士)
- 貴賓: 0.238
- 金幣: 17138.7
- 紅花: 43
- 帖子: 2251
- 在線: 712.4小時
- 蟲號: 111074
- 注冊: 2005-11-20
- 專業(yè): 生物化學(xué)
2樓2011-04-22 10:43:15
墨香若水
木蟲 (著名寫手)
小小囧蟲
- 應(yīng)助: 15 (小學(xué)生)
- 金幣: 3059.1
- 散金: 942
- 紅花: 10
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 1408
- 在線: 255.2小時
- 蟲號: 528502
- 注冊: 2008-03-19
- 性別: GG
- 專業(yè): 生物化學(xué)
4樓2011-04-22 13:43:12
elvias
鐵桿木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 18
- 應(yīng)助: 4 (幼兒園)
- 貴賓: 0.005
- 金幣: 5850.5
- 紅花: 7
- 帖子: 389
- 在線: 91.5小時
- 蟲號: 302177
- 注冊: 2006-12-02
- 性別: GG
- 專業(yè): 腫瘤免疫
5樓2011-04-22 15:25:08
yanying198
新蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 171.7
- 散金: 7
- 紅花: 1
- 帖子: 136
- 在線: 84.3小時
- 蟲號: 1038612
- 注冊: 2010-06-09
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+2): 鼓勵！把Buffer I和Buffer II的配方交出來就給你EPI ^_^ 2011-04-22 16:44:12
西瓜:編輯內(nèi)容 2011-04-22 19:09
西瓜(金幣+2, EPI+1): 鼓勵分享 2011-04-22 19:10:50
西瓜:編輯內(nèi)容 2011-04-22 19:11
西瓜(金幣+2): 鼓勵！把Buffer I和Buffer II的配方交出來就給你EPI ^_^ 2011-04-22 16:44:12
西瓜:編輯內(nèi)容 2011-04-22 19:09
西瓜(金幣+2, EPI+1): 鼓勵分享 2011-04-22 19:10:50
西瓜:編輯內(nèi)容 2011-04-22 19:11
|
我們使用超級感受態(tài)做轉(zhuǎn)化，傳給你你可以借鑒一下 （1）將-70℃保存的E.coli JM109于LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。 （2）挑接單克隆于LB液體試管（5 mL，Amp濃度為100 μg/mL），37℃ 200 rpm培養(yǎng)過夜。 （3）將上述培養(yǎng)菌液按4%比例轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃，250 rpm培養(yǎng)至OD值約為0.8。 （4）將菌液立即置于冰上10 min，4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體。 （5）加1/5原菌液體積的Buffer I，冰浴10 min，4℃，4000 rpm離心10 min。 （6）完全去上清，按原菌液體積的1/40～1/20加入Buffer II，分裝100 μL/1.5 mL離心管（可放置-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?br /> Buffer I: 30 mM KAC；100 mM KCl；10 mM CaCl2·2H2O；50 mM MnCl2；15%甘油；乙酸調(diào)pH 5.8，過濾除菌； Buffer II: 10 mM MOPS；10 mM KCl；75 mM CaCl2·2H2O；15% 甘油；NaOH調(diào)pH 6.8，過濾除菌； [ Last edited by 西瓜 on 2011-4-22 at 19:11 ] |
6樓2011-04-22 16:34:05
西瓜
榮譽(yù)版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 應(yīng)助: 94 (初中生)
- 貴賓: 3.157
- 金幣: 1849.6
- 散金: 11458
- 紅花: 116
- 沙發(fā): 21
- 帖子: 7553
- 在線: 1449.5小時
- 蟲號: 271749
- 注冊: 2006-08-13
- 性別: GG
- 專業(yè): 細(xì)胞衰老
- 管轄: 分子生物
8樓2011-04-22 16:45:20
yanying198
新蟲 (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 1 (幼兒園)
- 金幣: 171.7
- 散金: 7
- 紅花: 1
- 帖子: 136
- 在線: 84.3小時
- 蟲號: 1038612
- 注冊: 2010-06-09
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
呵呵 我給忘記粘了，我也沒配置過這兩個buffer，所以沒留意。 9樓2011-04-22 18:34:43
冼亮淀粉酶
專家顧問 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
專家經(jīng)驗: +248 - MolEPI: 46
- 應(yīng)助: 257 (大學(xué)生)
- 貴賓: 0.272
- 金幣: 19479.4
- 散金: 1704
- 紅花: 121
- 帖子: 6591
- 在線: 2779.1小時
- 蟲號: 856414
- 注冊: 2009-09-25
- 性別: GG
- 專業(yè): 環(huán)境微生物學(xué)
- 管轄: 微生物
【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(EPI+1): epi來也 2011-04-22 20:52:02
|
1、樓主培養(yǎng)細(xì)胞的時候轉(zhuǎn)接培養(yǎng)三次，引入受污染隱患。 2、樓主沒有試過用氯化鎂處理。 3、感受態(tài)細(xì)胞分裝到EP管中的時候，EP管要預(yù)冷，分裝好之后要放在冰中，一直到放到冰箱里保存都不該升溫。 4、感受態(tài)保存所用的溶液沒有加甘油，細(xì)胞放久了會死掉。 5、熱激之后放置在冰里并不只是為了冷卻，還要等待細(xì)胞壁修復(fù)。 6、6樓所用的E.coli JM109是不是已經(jīng)有了質(zhì)粒，不然為什么能抗Amp？我們不用E.coli JM109作表達(dá)菌株，里面是沒有西游密碼子質(zhì)粒的，做完了感受態(tài)之后要接種到含有Amp的LB中看長不長，如果能長就是感受態(tài)制作失敗了。不知道6樓實驗室是怎么使用E.coli JM109的，我只是奇怪，沒有針對6樓的意思。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
風(fēng)車少年10樓2011-04-22 19:55:45
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 niuniu2010 的主題更新
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 生物學(xué)學(xué)碩，一志愿湖南大學(xué)，初試成績338 +7 | YYYYYNNNNN 2026-03-26 | 8/400 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 266分，求材料相關(guān)專業(yè)調(diào)劑 +5 | 哇呼哼呼哼 2026-03-30 | 6/300 |
|
|
[考研] 085601材料工程找調(diào)劑 +17 | oatmealR 2026-03-29 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 0703一志愿9，初試成績：338，四六級已過，有科研經(jīng)歷，求調(diào)劑！ +7 | Zuhui0306 2026-03-25 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 291求調(diào)劑 +8 | HanBeiNingZC 2026-03-24 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 085701求調(diào)劑初試286分 +5 | secret0328 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 296求調(diào)劑 +10 | 彼岸t 2026-03-29 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +7 | 陳晨79 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分求調(diào)劑 +10 | 大饞小子 2026-03-28 | 10/500 |
|
|
|
[材料工程] 一志愿C9材料與化工專業(yè)總分300求調(diào)劑 +8 | 曼111 2026-03-24 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿211院校 344分 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)學(xué)碩，求調(diào)劑 +5 | 丶風(fēng)雪夜歸人丶 2026-03-26 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 085600，材料與化工321分調(diào)劑 +4 | 大饞小子 2026-03-27 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +4 | 小懶蟲不懶了 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 一志愿 本科 北科大 化學(xué) 343 +6 | 13831862839 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 085602化學(xué)工程求調(diào)劑。
+4
|
平樂樂樂 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研]
 085602 289分求調(diào)劑
+8
|
WWW西西弗斯 2026-03-24 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 289求調(diào)劑 +17 | 碩星赴 2026-03-23 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京郵電大學(xué) 288分 材料考研 求調(diào)劑 +3 | jl0720 2026-03-26 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 309求調(diào)劑 +4 | gajsj 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿哈工大，085400，320，求調(diào)劑 +4 | gdlf9999 2026-03-24 | 4/200 |
|