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感受態(tài)的制備及轉化？
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這是我制備感受態(tài)及轉化的流程，近期轉化一直不成功，請大家給予指導。轉化所用質粒是長期存于-40℃的，不知道影響大不？ （一）DH5a菌感受態(tài)的制備： 1、從LB平板上挑取DH5a單菌落,接種于3LB液體培養(yǎng)基中 37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右直至對數(shù)生長后期培養(yǎng)基中。 2、將菌懸液以1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再將菌懸液以1:100的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生長對數(shù)期），約2-3h 3、將菌液轉移到兩只預冷的50ml無菌離心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 4、每只離心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌體重懸，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 5、每只離心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸后分裝到無菌的1.5ml離心管中(每管100µl)； 6、置-40℃冰箱長期保存； （二）DH5a大腸桿菌的熱擊轉化： ⑴ 分別在1管100µl感受態(tài)細胞中加入質粒1-2µl和無菌水1-2µl（陰性對照），輕輕旋轉以混勻內(nèi)溶物，冰浴30min； ⑵ 將離心管放至42℃的循環(huán)水浴中90s； ⑶ 快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻至室溫； ⑷ 每管加800µl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中45min； ⑸ 取l轉化的感受態(tài)細胞，分別轉移到含相應抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻璃棒將菌液涂滿整個平板表面； ⑹ 將平板置于超凈臺中直至平板表面菌液被吸收； ⑺ 封好平皿，倒置于37℃培養(yǎng)，12-16h。 [ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ] |
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