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niuniu2010銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化？
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這是我制備感受態(tài)及轉(zhuǎn)化的流程，近期轉(zhuǎn)化一直不成功，請(qǐng)大家給予指導(dǎo)。轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒是長(zhǎng)期存于-40℃的，不知道影響大不？ （一）DH5a菌感受態(tài)的制備： 1、從LB平板上挑取DH5a單菌落,接種于3LB液體培養(yǎng)基中 37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期培養(yǎng)基中。 2、將菌懸液以1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再將菌懸液以1:100的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期），約2-3h 3、將菌液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的50ml無菌離心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 4、每只離心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌體重懸，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清； 5、每只離心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸后分裝到無菌的1.5ml離心管中(每管100µl)； 6、置-40℃冰箱長(zhǎng)期保存； （二）DH5a大腸桿菌的熱擊轉(zhuǎn)化： ⑴ 分別在1管100µl感受態(tài)細(xì)胞中加入質(zhì)粒1-2µl和無菌水1-2µl（陰性對(duì)照），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)溶物，冰浴30min； ⑵ 將離心管放至42℃的循環(huán)水浴中90s； ⑶ 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻至室溫； ⑷ 每管加800µl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱中45min； ⑸ 取l轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用一無菌的彎頭玻璃棒將菌液涂滿整個(gè)平板表面； ⑹ 將平板置于超凈臺(tái)中直至平板表面菌液被吸收； ⑺ 封好平皿，倒置于37℃培養(yǎng)，12-16h。 [ Last edited by 1949stone on 2011-4-23 at 10:55 ] |
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elvias
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dhd997(金幣+3): good 2011-04-22 13:56:15
niuniu2010(金幣+1): 2011-04-22 15:27:59
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你的流程沒什么問題，是標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)化流程。 你需要注意的是，如果感受態(tài)細(xì)胞要長(zhǎng)期保存的話，最好分裝后液氮速凍，然后置于-80度，基本上可以使用一年。 你轉(zhuǎn)化不出的原因可能出在質(zhì)粒上，如果你的質(zhì)粒濃度不高又在-40保存時(shí)間過長(zhǎng)的話，建議在轉(zhuǎn)化過程中可以稍微多加一點(diǎn)。 |
3樓2011-04-22 13:12:01
beibei9535
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7樓2011-04-22 16:35:57
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5樓2011-04-22 15:25:08
yanying198
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜:編輯內(nèi)容 2011-04-22 19:11
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我們使用超級(jí)感受態(tài)做轉(zhuǎn)化，傳給你你可以借鑒一下 （1）將-70℃保存的E.coli JM109于LB平板上劃線，37℃培養(yǎng)過夜。 （2）挑接單克隆于LB液體試管（5 mL，Amp濃度為100 μg/mL），37℃ 200 rpm培養(yǎng)過夜。 （3）將上述培養(yǎng)菌液按4%比例轉(zhuǎn)接新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃，250 rpm培養(yǎng)至OD值約為0.8。 （4）將菌液立即置于冰上10 min，4℃，4000 rpm離心10 min，收集菌體。 （5）加1/5原菌液體積的Buffer I，冰浴10 min，4℃，4000 rpm離心10 min。 （6）完全去上清，按原菌液體積的1/40～1/20加入Buffer II，分裝100 μL/1.5 mL離心管（可放置-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?br /> Buffer I: 30 mM KAC；100 mM KCl；10 mM CaCl2·2H2O；50 mM MnCl2；15%甘油；乙酸調(diào)pH 5.8，過濾除菌； Buffer II: 10 mM MOPS；10 mM KCl；75 mM CaCl2·2H2O；15% 甘油；NaOH調(diào)pH 6.8，過濾除菌； [ Last edited by 西瓜 on 2011-4-22 at 19:11 ] |
6樓2011-04-22 16:34:05
西瓜
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8樓2011-04-22 16:45:20
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呵呵 我給忘記粘了，我也沒配置過這兩個(gè)buffer，所以沒留意。 9樓2011-04-22 18:34:43
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(EPI+1): epi來也 2011-04-22 20:52:02
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1、樓主培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候轉(zhuǎn)接培養(yǎng)三次，引入受污染隱患。 2、樓主沒有試過用氯化鎂處理。 3、感受態(tài)細(xì)胞分裝到EP管中的時(shí)候，EP管要預(yù)冷，分裝好之后要放在冰中，一直到放到冰箱里保存都不該升溫。 4、感受態(tài)保存所用的溶液沒有加甘油，細(xì)胞放久了會(huì)死掉。 5、熱激之后放置在冰里并不只是為了冷卻，還要等待細(xì)胞壁修復(fù)。 6、6樓所用的E.coli JM109是不是已經(jīng)有了質(zhì)粒，不然為什么能抗Amp？我們不用E.coli JM109作表達(dá)菌株，里面是沒有西游密碼子質(zhì)粒的，做完了感受態(tài)之后要接種到含有Amp的LB中看長(zhǎng)不長(zhǎng)，如果能長(zhǎng)就是感受態(tài)制作失敗了。不知道6樓實(shí)驗(yàn)室是怎么使用E.coli JM109的，我只是奇怪，沒有針對(duì)6樓的意思。 |
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風(fēng)車少年10樓2011-04-22 19:55:45
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