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lzhaowin木蟲 (小有名氣)
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[求助]
16S PCR擴(kuò)增的問題
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上周五做的16S PCR，擴(kuò)增效果很好，而且做了連接和轉(zhuǎn)化~ 周日發(fā)現(xiàn)Taq E結(jié)冰了，重新訂了新的Taq E。 周二再重復(fù)做16S PCR的時(shí)候就發(fā)現(xiàn)沒有目的條帶，陽性對(duì)照條帶很弱。懷疑是dNTPs快用完了，有可能降解了，所以換了新的dNTPs，結(jié)果電泳檢測(cè)杯具的發(fā)現(xiàn)神馬都沒有！ 后來接著重新稀釋100uM的引物母液至10uM，又換了實(shí)驗(yàn)室另一種Taq E同樣是沒有條帶，陽性對(duì)照很弱。 懷疑是現(xiàn)在用的模板降解了？今天重復(fù)了上周五用的模板，結(jié)果還是悲催的沒有任何條帶？為什么呀？為什么？上周能做出來，這周就不行了！  望各路大俠賜教~ |
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★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)分享經(jīng)驗(yàn)。 2011-04-28 19:35:25
lzhaowin(金幣+3): 謝謝你的經(jīng)驗(yàn)~ 2011-04-28 21:42:10
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)分享經(jīng)驗(yàn)。 2011-04-28 19:35:25
lzhaowin(金幣+3): 謝謝你的經(jīng)驗(yàn)~ 2011-04-28 21:42:10
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4樓2011-04-28 17:34:47
zemin_fang
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-28 19:35:09
lzhaowin(金幣+3): 謝謝~水我也換過了，還是不解決問題~ 2011-04-28 21:38:59
amisking(金幣+2): 鼓勵(lì)發(fā)帖應(yīng)助。 2011-04-28 19:35:09
lzhaowin(金幣+3): 謝謝~水我也換過了，還是不解決問題~ 2011-04-28 21:38:59
| 鑒于上述情況，建議你先仔細(xì)核對(duì)你的PCR程序是否被他人改動(dòng)。如果程序前后未動(dòng)，對(duì)于PCR來說，反應(yīng)體系中含有如下成分：buffer、模板、dNTP、引物、酶以及用于補(bǔ)足體積的水。你嘗試過跟換引物、酶、dNTP，那么就再更換剩下的幾種吧。不要忽略水，如果水被污染也會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。 |
2樓2011-04-28 16:57:22
wallace974
木蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
amisking(金幣+2): 獎(jiǎng)勵(lì)，辛苦了。 2011-04-28 19:35:16
lzhaowin(金幣+3): 我寫“E”就是“酶”的意思~用的就是普通的Taq酶~謝謝~ 2011-04-28 21:40:38
amisking(金幣+2): 獎(jiǎng)勵(lì)，辛苦了。 2011-04-28 19:35:16
lzhaowin(金幣+3): 我寫“E”就是“酶”的意思~用的就是普通的Taq酶~謝謝~ 2011-04-28 21:40:38
| 為什么用taq E呢？普通的Taq不就可以了，而且還結(jié)冰了，普通的taq也不會(huì)結(jié)冰啊，建議換普通taq，72度延伸時(shí)間設(shè)定為2min就可以了。模板可以直接取1uL菌液或一個(gè)單克隆，PCR程序設(shè)定95度5分鐘就可以裂解細(xì)胞，16S比較好擴(kuò)的。 |
3樓2011-04-28 17:06:19
rb
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5樓2011-04-28 23:44:35
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