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zxjdawn

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[求助] 通用引物擴增細菌16S rDNA

我用通用引物擴增細菌16S rDNA，直接菌落PCR，我試了7、8次，每次都有700bp左右的的非特異性擴增，目的片段也有，在1500bp左右，我老師說他以前一做就出來了，根本沒有非特異性擴增，為什么我每次都有呢，請各位蟲友幫幫我~~~PCR體系如下（50uL體系）：
10*Buffer                         5UL
MgCl2（50mM）                2uL
引物a（10uL）                1.5uL
引物b（10uL）                1.5uL
dNTP（10mM）                1uL
Taq酶（2U/uL）                1uL
模板                                  槍頭蘸取一點菌
ddH2O                               38uL
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
94度預變性5min
94度       45s
56度       45s
72度       90s
30個循環(huán)
問題到底出在哪里呢？我的退火溫度從55-59度都試過，59度就沒有條帶了，引物從1、1.5、2uL的都試過，預變性時間從5、10、12min都試過，還試過把前一次PCR產物取1uL做模板，都有非特異性條帶，為么捏？？？望大蝦不吝賜教，小女先謝謝大家了~~

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1樓 2011-08-19 16:12:07

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★
lstt09nk(金幣+1): 感謝參與 2011-08-19 18:18:42
zxjdawn(金幣+1): 謝謝 2011-08-19 22:12:17

可能是菌沒有完全裂解吧，試沸水浴或延長預變性時間。

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2樓2011-08-19 16:31:23

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zxjdawn

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2樓: Originally posted by ghost9106 at 2011-08-19 16:31:23:
可能是菌沒有完全裂解吧，試沸水浴或延長預變性時間。

可是我試過預變性時間12min了，我覺得時間應該夠長了吧。。。我還試過把菌挑到ddH2O里面，95度10min，再離心取上清做模板，結果還是一樣，我就弄不明白問題到底出在哪里呢？？？？

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3樓2011-08-19 22:15:20

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wqj1988926

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會不會是引物出現(xiàn)問題了，引物如果反復凍融的話有可能會裂解斷裂。

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風雪夜歸人

4樓2011-08-20 09:00:12

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zxjdawn

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引用回帖:

4樓: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-20 09:00:12:
會不會是引物出現(xiàn)問題了，引物如果反復凍融的話有可能會裂解斷裂。

可是引物是新合成的呢，，，我現(xiàn)在只能懷疑是引物序列出了問題，謝謝了~~~

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5樓2011-08-20 09:36:00

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hzl5888

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adslye(金幣+1): 感謝交流~祝順利！ 2011-08-21 09:43:57

建議在菌株上找找原因，會不會是這株菌的遺傳性狀不穩(wěn)定，或許在傳代的過程中產生了突變，這是非常有可能的。

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6樓2011-08-20 10:12:56

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zxjdawn

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6樓: Originally posted by hzl5888 at 2011-08-20 10:12:56:
建議在菌株上找找原因，會不會是這株菌的遺傳性狀不穩(wěn)定，或許在傳代的過程中產生了突變，這是非常有可能的。

謝謝了，我本來是要鑒定乳桿菌，可是我也試過我自己分離到的解淀粉芽孢桿菌，結果沒差異，兩株菌都變異的可能性應該微乎其微吧。。。

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7樓2011-08-20 10:27:03

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j2

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adslye(金幣+1): 感謝交流~祝順利！ 2011-08-21 09:44:11

為什么非要跑出一條帶不可？直接切1500bp的膠回收就是了塞
通用引物在菌株基因的其他位置結合很正常吧~~~

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修煉ｉｎｇ，當蟲仙……

8樓2011-08-20 13:06:37

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dyyyyy

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adslye(金幣+1): 感謝交流~祝順利！ 2011-08-21 09:44:29

有就有唄。那不是主要問題。膠回收目的片段，回收產物作模板再p一次。就ok了。

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9樓2011-08-20 21:56:15

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adslye(金幣+2): 感謝交流，祝順利！ 2011-08-22 08:56:18
lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-08-22 12:34:53

引用回帖:

7樓: Originally posted by zxjdawn at 2011-08-20 10:27:03:
謝謝了，我本來是要鑒定乳桿菌，可是我也試過我自己分離到的解淀粉芽孢桿菌，結果沒差異，兩株菌都變異的可能性應該微乎其微吧。。。

如果菌株沒有問題的話，建議在組分濃度上找找原因，因為我這里看不到你的引物濃度，會不會是引物濃度太高，如果引物的濃度很高產生引物二聚體的概率就比較高。也有可能是菌株不純，還有可能是體系中出現(xiàn)了污染。雖然我沒有做過你說的這個擴增，但是我做熒光定量時出現(xiàn)非特異性擴增都會從以上幾方面找原因，我想既然都是PCR，原理都是一樣的，分析原因應該也可以通用吧。希望能幫到你。

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10樓2011-08-21 22:13:23

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