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通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA
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我用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，直接菌落PCR，我試了7、8次，每次都有700bp左右的的非特異性擴(kuò)增，目的片段也有，在1500bp左右，我老師說他以前一做就出來了，根本沒有非特異性擴(kuò)增，為什么我每次都有呢，請(qǐng)各位蟲友幫幫我~~~PCR體系如下（50uL體系）： 10*Buffer 5UL MgCl2（50mM） 2uL 引物a（10uL） 1.5uL 引物b（10uL） 1.5uL dNTP（10mM） 1uL Taq酶（2U/uL） 1uL 模板 槍頭蘸取一點(diǎn)菌 ddH2O 38uL ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 94度預(yù)變性5min 94度 45s 56度 45s 72度 90s 30個(gè)循環(huán) 問題到底出在哪里呢？我的退火溫度從55-59度都試過，59度就沒有條帶了，引物從1、1.5、2uL的都試過，預(yù)變性時(shí)間從5、10、12min都試過，還試過把前一次PCR產(chǎn)物取1uL做模板，都有非特異性條帶，為么捏？？？望大蝦不吝賜教，小女先謝謝大家了~~ |
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ghost9106
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8樓2011-08-20 13:06:37
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9樓2011-08-20 21:56:15
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adslye(金幣+2): 感謝交流，祝順利！ 2011-08-22 08:56:18
lstt09nk(金幣+2): 感謝參與 2011-08-22 12:34:53
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如果菌株沒有問題的話，建議在組分濃度上找找原因，因?yàn)槲疫@里看不到你的引物濃度，會(huì)不會(huì)是引物濃度太高，如果引物的濃度很高產(chǎn)生引物二聚體的概率就比較高。也有可能是菌株不純，還有可能是體系中出現(xiàn)了污染。雖然我沒有做過你說的這個(gè)擴(kuò)增，但是我做熒光定量時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增都會(huì)從以上幾方面找原因，我想既然都是PCR，原理都是一樣的，分析原因應(yīng)該也可以通用吧。希望能幫到你。 |
10樓2011-08-21 22:13:23
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