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通用引物擴增細菌16S rDNA
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我用通用引物擴增細菌16S rDNA，直接菌落PCR，我試了7、8次，每次都有700bp左右的的非特異性擴增，目的片段也有，在1500bp左右，我老師說他以前一做就出來了，根本沒有非特異性擴增，為什么我每次都有呢，請各位蟲友幫幫我~~~PCR體系如下（50uL體系）： 10*Buffer 5UL MgCl2（50mM） 2uL 引物a（10uL） 1.5uL 引物b（10uL） 1.5uL dNTP（10mM） 1uL Taq酶（2U/uL） 1uL 模板 槍頭蘸取一點菌 ddH2O 38uL ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 94度預變性5min 94度 45s 56度 45s 72度 90s 30個循環(huán) 問題到底出在哪里呢？我的退火溫度從55-59度都試過，59度就沒有條帶了，引物從1、1.5、2uL的都試過，預變性時間從5、10、12min都試過，還試過把前一次PCR產(chǎn)物取1uL做模板，都有非特異性條帶，為么捏？？？望大蝦不吝賜教，小女先謝謝大家了~~ |
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dyyyyy
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