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[求助] PICZaA在GS115內表達跨膜蛋白

1，PICZaA在GS115內的分泌表達后，上清主要有什么蛋白？一般在多大KD的？
2，PICZaA在GS115內表達跨膜蛋白的時候，跨膜蛋白的跨膜區(qū)需要處理掉嗎？

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1樓 2011-04-28 17:16:07

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susizheng

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★ ★ ★
1949stone(金幣+3): 高手高高手 2011-04-28 19:00:40
pidou213(金幣+1): 還是應該感謝一下 2011-04-29 08:37:10
pidou213(金幣+1): 講的有道理 2011-05-10 12:31:38
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pidou213(金幣+2): xx 2011-07-17 16:24:06

1.這個應該需要通過跑PAGE來確定。
2.最好除掉，因為分泌用的是PICZaA上的a factor。不切掉跨膜區(qū)，表達時，酵母不一定能夠正確的去剪切。
如果我做，估計得切跨膜區(qū)做一個，不切做一個。做個對照，因為最終酶活最能說明問題。

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2樓2011-04-28 17:54:51

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引用回帖:

Originally posted by susizheng at 2011-04-28 17:54:51:
1.這個應該需要通過跑PAGE來確定。
2.最好除掉，因為分泌用的是PICZaA上的a factor。不切掉跨膜區(qū)，表達時，酵母不一定能夠正確的去剪切。
如果我做，估計得切跨膜區(qū)做一個，不切做一個。做個對照，因為最終酶活 ...

首先感謝你的回復，但是我想說的是，我之所以求助，就是因為我不確定，所以想找人來指導一下，結果你說了半天都是拿不定的答案，并且你也知道，做這個酵母表達很麻煩的，如果我自己有時間試一試的話，我還來求助做什么呢

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3樓2011-04-29 08:36:24

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1.這個應該需要通過跑PAGE來確定

這個問題，我的意思是想問問做過的人，拿張圖或者根據(jù)自己的所知來回答，結果你說用PAGE膠來確定，你實在是太實在了，我相信做蛋白的就知道用PAGE來確定蛋白的吧？@

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4樓2011-04-29 08:38:56

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susizheng

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引用回帖:

Originally posted by pidou213 at 2011-04-29 08:36:24:
首先感謝你的回復，但是我想說的是，我之所以求助，就是因為我不確定，所以想找人來指導一下，結果你說了半天都是拿不定的答案，并且你也知道，做這個酵母表達很麻煩的，如果我自己有時間試一試的話，我還來求 ...

酵母表達很煩嗎？我從質粒構建到整合到表達到純化，一共化了兩個星期。
不是我讓你試，是你的蛋白要想做出最優(yōu)的表達，是不得不試，你看些綜述就知道了。
做實驗本來就是紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行的。

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5樓2011-04-30 11:09:26

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Originally posted by susizheng at 2011-04-30 11:09:26:
酵母表達很煩嗎？我從質粒構建到整合到表達到純化，一共化了兩個星期。
不是我讓你試，是你的蛋白要想做出最優(yōu)的表達，是不得不試，你看些綜述就知道了。
做實驗本來就是紙上得來終覺淺，絕知此事要躬行的。

我從質粒構建到整合到表達到純化，一共化了兩個星期。

我真的很佩服你對不起，碰上高手了

但是據(jù)我所知，載體構建后需要測序驗證，然后轉化后酵母需要培養(yǎng)2-3天才能長出。然后你還要再次確定是否轉化進去了（——也就是說是否是假陽性），然后誘導表達需要至少鑒定四天的再然后做Western 至少一天才能出結果把？

兩個星期我實在佩服

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6樓2011-04-30 18:32:09

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roomofxw

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引用回帖:

Originally posted by pidou213 at 2011-04-30 18:32:09:
我從質粒構建到整合到表達到純化，一共化了兩個星期。

我真的很佩服你對不起，碰上高手了

但是據(jù)我所知，載體構建后需要測序驗證，然后轉化后酵母需要培養(yǎng)2-3天才能長出。然后你還要再次確定是否轉化 ...

做的順手的話，中間不出什么問題
e.coli大約也就只要一周時間左右唄，酵母費勁點，長的慢些，但也要不了太久。

當然中間不出問題，不需要優(yōu)化…要是有問題了，那可能兩年也做不出來

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7樓2011-04-30 23:22:09

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Originally posted by roomofxw at 2011-04-30 23:22:09:
做的順手的話，中間不出什么問題
e.coli大約也就只要一周時間左右唄，酵母費勁點，長的慢些，但也要不了太久。

當然中間不出問題，不需要優(yōu)化…要是有問題了，那可能兩年也做不出來

好吧總的來說還是感謝你的答復真希望在現(xiàn)實中有這么一個諍友，或許實驗就會快很多，進步會快很多，哈哈你在哪個城市？

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8樓2011-05-01 09:12:40

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Originally posted by pidou213 at 2011-05-01 09:12:40:
好吧總的來說還是感謝你的答復真希望在現(xiàn)實中有這么一個諍友，或許實驗就會快很多，進步會快很多，哈哈你在哪個城市？

北京

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9樓2011-05-02 21:06:42

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Originally posted by roomofxw at 2011-05-02 21:06:42:
北京

不會是中國農業(yè)大學的吧？

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10樓2011-05-02 22:42:01

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