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caojinxuan

銀蟲 (正式寫手)

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[求助] 有關(guān)引物設(shè)計(jì)問題

大家好，本人是新手，想請教有關(guān)引物設(shè)計(jì)問題，一下是要擴(kuò)增的目的基因序列：

1 atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa
   61 tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt ccggtctgcg tatcaacagc
   121 gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt
   181 ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc
   241 gcgctgaacg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct
   301 aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac ccagcgcctg
   361 aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg gcgtgaaagt cctggcgcag
   421 gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg
   481 aagcagatca actctcagac cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag
   541 gtcagcgata cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat
   601 agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat tgatggcgat
   661 ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag ttaccgttac ggggggaact
   721 ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt gataagacga acggtaaggt gactcttgct
   781 ggcggtgcga cttccccgct tacaggtgga ctacctgcga cagcaactga ggatgtgaaa
   841 aatgtacaag ttgcaaatgc tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt
   901 gttaccggca cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt
   961 gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca aaataaagat
   1021 ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg acggtacatc caaaactgca
   1081 ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa accgaagttg tttctattgg tggtaaaact
   1141 tacgctgcaa gtaaagccga aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg
   1201 gctgctacaa ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ctgctttggc acaggttgac
   1261 acgttacgtt ctgacctggg tgcggtacag aaccgtttca actccgctat taccaacctg
   1321 ggcaacaccg taaacaacct gacttctgcc cgtagccgta tcgaagattc cgactacgcg
   1381 accgaagttt ccaacatgtc tcgcgcgcag attctgcagc aggccggtac ctccgttctg
   1441 gcgcaggcga accaggttcc gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa

FLICF: 5`-gggaattc CATATG gcacaag tcattaatac-3`
FLICR: 5`-ccgCTCGAG ttaacccagtaaagagaggacgt-3`
這是我設(shè)計(jì)的引物，不知道可行不可行

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【求助/交流】緊急求助~~ 關(guān)于簡并引物設(shè)計(jì) codehop 和genefisher 在線已經(jīng)有12人回復(fù)
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克隆基因全長引物設(shè)計(jì)問題已經(jīng)有32人回復(fù)

累事經(jīng)年，仰天嘯月間情感俱傷縱馬橫川，劍指遠(yuǎn)峰處星河燦爛

1樓 2011-04-29 11:39:21

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【答案】應(yīng)助回帖

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dhd997(金幣+6, EPI+1): 應(yīng)助一并獎(jiǎng)勵(lì)！ 2011-04-30 09:14:57

FLICR: 5`-ccgCTCGAG ttaacccagtaaagagaggacgt-3`
如果你給的序列是對的
這個(gè)就是錯(cuò)的了應(yīng)該是CGC而不是CCC吧
你加了酶切識(shí)別序列嗎？
貌似你這些都沒說，只說這些，沒人知道到底是合適不合適

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2樓2011-04-30 05:09:15

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【答案】應(yīng)助回帖

caojinxuan(金幣+1): 謝謝 2011-05-12 20:21:03

你這是要做表達(dá)嗎
那還要看你的載體
引物中是不是要加一些堿基，不要改變了讀碼框

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3樓2011-04-30 05:11:37

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【答案】應(yīng)助回帖

caojinxuan(金幣+2): 謝謝 2011-05-12 20:21:15

兩個(gè)引物TM值相差很大，建議再好好看一下
一個(gè)57.7 一個(gè)是65
如果第一個(gè)引物前邊是保護(hù)堿基的話，建議修改一下。來提高tm值
（也有人說tm值不應(yīng)該包括保護(hù)堿基，不過偶們都是算在里邊的）
不管你是新手還是什么手，基本知識(shí)還是要有的吧
ps：本人也是前幾天才開始琢磨怎么設(shè)計(jì)引物

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4樓2011-04-30 06:02:38

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bluepapa

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5樓2011-04-30 11:33:00

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大寫的是酶切位點(diǎn)，可是我身邊只有NdeI

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6樓2011-05-03 22:17:26

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我的載體用的是Pet-28a

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7樓2011-05-03 22:18:24

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★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, EPI+1): 辛苦了！ 2011-05-04 00:47:56

這是不是你的載體序列？如果不是，請?zhí)峁┮幌履愕膬蓚€(gè)酶切之間的序列，及讀碼
我在網(wǎng)上搜的，如果不對的話，你提供一下
圖譜

序列
NdeI Type II restriction enzyme 5' CA^TATG 3'
NcoI Type II restriction enzyme 5' C^CATGG 3'
NdeI 和NcoI 之間的序列，
C ATA TGG CTG CCG CGCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGGAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATC
如果我現(xiàn)在給出的兩個(gè)酶之間的序列是對的，那你的引物不僅退火溫度相差大，
而且讀碼框也改變了，所以你自己多看書，好好琢磨一下吧
這是第一步，如果這里弄不好，下邊做再多也沒用

ps：偶是新手，如有不當(dāng)之處，歡迎討論

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8樓2011-05-03 23:27:15

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dhd997(金幣+2): 歡迎探討 2011-05-04 11:04:10

上傳了我的質(zhì)粒圖譜和NdeI及NcoI間的序列，好像和樓上說的有出入

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9樓2011-05-04 09:15:25

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★ ★ ★
西瓜(金幣+3): 熱心！話說圖我也看不到…… 2011-05-05 09:11:37
caojinxuan(金幣+2): 2011-05-06 20:15:46
caojinxuan(金幣+1): 謝謝 2011-05-19 16:34:18

引用回帖:

Originally posted by caojinxuan at 2011-05-04 09:15:25:
上傳了我的質(zhì)粒圖譜和NdeI及NcoI間的序列，好像和樓上說的有出入

對不起
我今天打開網(wǎng)頁什么圖片都看不到
如果你能等的話，我看到了在討論
如果你感覺讀碼框沒有問題的話，只是退火的問題，那就可以修改一下，去合成了

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10樓2011-05-05 00:23:16

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